家蚕幼虫嗅觉组织中气味降解酯酶的功能及作用机制研究

Odorant-degrading esterase is one of the important detoxification enzymes in the insect olfactory tissues, which plays roles in hydrolyzing the acetate esters to maintain the sensitivities of the olfactory receptor neurons (ORNs). The previous studies indicated that the olfactory tissues in the moth insect contained large numbers of odorant-degrading esterase genes. It suggested that odorant-degrading esterases might have new functions, such as degrading the deleterious volatile esters. While these new functions have not yet been confirmed in the insect. In our previous study, we found that the expression of silkworm Bmae32 gene in the olfactory tissures during larval stages was significantly induced after suffocating exposure to phoxim. In present study, we will study the temporal and spatial expression patterns, detect the degrading activities and enzyme characteristics, and use RNA interference (RNAi) technology to understand the function and molecular mechanism of the odorant-degrading esterase gene. Through the functional analysis of Bmae32 gene, it might help us understand the roles of the odorant-degrading esterases in larval olfactory response and protecting ORNs from harmful volatile pollutants. It will be helpful to mining new targets and exploitation of an new technology for controlling lepidopteran pests, which has important theoretical and practical implications.

气味降解酯酶是昆虫嗅觉组织中重要的解毒酶，在嗅觉反应中具有降解酯类信号分子以保持嗅觉受体神经元敏感性的重要作用。已有研究发现蛾类昆虫嗅觉组织中存在大量的气味降解酯酶基因，引发了人们对其是否具有对酯类有害气味分子解毒新功能的猜想，但至今未得到证实。我们的初步研究发现家蚕幼虫嗅觉组织中的气味降解酯酶候选基因Bmae32能被辛硫磷诱导表达，暗示着该基因可能参与了有害气味分子的解毒。本研究将在此基础上鉴定Bmae32在家蚕幼虫嗅觉组织内的时空表达模式，并通过对Bmae32的体外降解活性、酶学特性及RNAi等研究，进一步阐明该基因在家蚕幼虫寄主选择的嗅觉反应及保护感受神经元免受有害气味分子刺激中的作用机制。该研究的实施和完成可望第一次揭示气味降解酯酶在家蚕幼虫嗅觉组织中的功能，有助于鳞翅目害虫新靶标的发掘及防治新技术的开发，有重要理论和实践意义。

气味降解酯酶是昆虫嗅觉组织中重要的解毒酶，在嗅觉反应中具有降解酯类信号分子以保持嗅觉受体神经元敏感性的重要作用。昆虫成虫嗅觉组织中的气味降解酯酶对信息素及其他气味物质的降解功能得到了较深入的研究，而幼虫嗅觉组织中气味降解酯酶的功能及作用机理尚不清楚。本项目正是在综合以前研究基础之上，选取家蚕幼虫嗅觉组织中的Bmae32作为气味降解酯酶的重要候选基因，对其功能进行了鉴定。首先，分析了Bmae32在家蚕幼虫各组织的表达，发现其在雌/雄幼虫触角和下颚组织中的表达均较高，在体壁有较低的表达，而在其他组织基本不表达。我们分析了该基因在家蚕4龄至上蔟24 h间幼虫触角和下颚的表达，均检测到了较高量的表达水平。以辛硫磷和(Z)-3-hexenyl acetate、(E)-2-hexenyl acetate气味物质熏蒸处理家蚕，发现Bmae32的表达水平被显著诱导，辛硫磷诱导其表达上升至1.8-2.1倍。我们对Bmae32全长cDNA进行克隆，其编码区长度为1551 bp。并将其构建至pET28原核表达载体中进行原核表达与纯化，及制备了多克隆抗体。免疫组织化学分析表明，Bmae32编码的蛋白在家蚕幼虫触角和下颚中均有表达。我们将Bmae32基因全长cDNA克隆构建至真核表达载体pIZ-V5-His中，并对重组表达蛋白进行纯化，体外证实目的蛋白能代谢顺式-3-己烯乙酸酯和反式-2-己烯乙酸酯气味物质。RNA干扰实验也证实Bmae32在保护幼虫的嗅觉神经元中起着重要的作用。研究内容的实现，不仅有助于揭示幼虫嗅觉组织中COEs基因在家蚕食性生理和环境适应性中的作用机制，也可望为害虫防治新靶标的发掘开拓新的思路。