当归酸性多糖调控Galectin-3介导白血病细胞凋亡的糖链核心结构及构效关系研究

当归多糖能有效抑制白血病细胞的增殖，但其结构和作用机制复杂，构效研究进展缓慢。近年来，具有抑制半乳凝素-3(Gal-3)从而调控肿瘤细胞凋亡作用多糖的发现，为中药药效物质基础的研究带来了新的视角。前期研究中，我们首次得到了8种当归均一性多糖组分和多种多糖片段，发现其中2种酸性多糖可明显抑制Gal-3表达并诱导白血病细胞凋亡，提示当归多糖糖链中可能存在核心结构单元与Gal-3特异性结合，产生治疗白血病的作用。本研究拟结合化学和波谱法进一步分析上述酸性多糖的一级结构，并用酶法降解多糖，固相结合法分析多糖片段与Gal-3的亲和性，流式细胞术、细胞生物学等多种方法测定凋亡诱导活性，从而筛选活性多糖片段并分析其完整一级结构；此外，通过15N-1H-HSQC测定多糖片段与Gal-3的结合常数深入探讨当归多糖抑制Gal-3的构效关系。渴望揭示当归多糖治疗白血病的药效基础，为中药多糖药效研究提供新思路。

当归多糖能有效抑制白血病细胞的增殖，但其结构和作用机制复杂，构效研究进展缓慢。本课题对当归酸性多糖进行了系统地提取、分离，一级结构解析；用酶法降解多糖，并以半乳糖凝集素-3（Gal-3）为作用靶点筛选活性多糖及片段；进一步通过多糖片段的结构分析和体、内外抗白血病作用的研究，揭示当归多糖治疗白血病的药效基础。课题组优化了当归酸性多糖的提取分离工艺，共得到重均分子量为1.7×104、2.3×103、7.2×105、1.0×104、5.9×105和8.1×103 Da的6种当归酸性多糖；首次引入四氢呋喃为HPLC流动相，实现了多糖中中性糖、糖醛酸和氨基糖的同时、快速测定；6种当归酸性均一性多糖的单糖组成中均含有甘露糖和氨基糖，目前以上单糖组成的多糖未见文献报道。6种多糖对白血病K562细胞的增殖呈现不同程度的抑制作用；其中抑制作用较高的三种酸性多糖的结构单元分别为：AAPS-1II，Rha-(1→4)-GalA-(1→2)-Manp-(1→6)-Manp-(1→、Manp-[(1→6)-Manp-(1→]n；AAPS-2I，→3)-GalA-(1→2)-Manp-(1→4)-Glcp-(1→2)-Manp-(1→、Manp-[(1→2)-Manp-(1→]n、Galp-[(1→4)-Glcp-(1→]n；AAPS-2II的结构中主要含有T-Galp、1,6-Rha、1,2-Manp和1,3,6-Manp残基。根据活性多糖AAPS-2I和AAPS-2II的结构进行降解，共得到10种酶解片段和4种部分酸水解产物。其中分子量6.3×104 Da，结构中含有1,4-Glcp，1,4-GlcpNAc和1,4-Galp主链，T-Manp及T-Galp分枝的酶解片段2I-MAEH-1与Gal-3的亲和作用最强，可通过抑制Gal-3，进而调控线粒体通路，诱导体内、外K562细胞凋亡。通过目前得到的实验结果，确定的当归多糖抗白血病初步构效关系为：酸性多糖的活性与分子量大小无关；→4)-Glcp-(1→4)-GlcpNAc-(1→4)-Galp-(1→是重要的活性单元；1,2-Manp位点与活性无明显关系；多糖酸化降解后活性丧失。本研究建立了解析多糖单糖组成的新方法，首次发现了6种新结构当归酸性多糖，初步阐明当归多糖诱导白血病细胞凋亡的作用机理和结构基础。为多糖药物的研发提供了实验依据。