microRNAs纳米粒子调控P-糖蛋白逆转难治性癫痫耐药的作用

P-glycoprotein (P-gp) is one of multidrug transporters involved in multidrug resistance in medically intractable epilepsy. There is the limitation of using exogenous drugs to target the P-gp clinically due to side effects and lack of tissue-specific. Therefore, finding endogenous and brain targeting molecules which regulate P-gp expression may help to solve this problem. Our previous studies have shown that microRNAs（miRNAs） as endogenous small RNA molecules can regulate the expression of P-gp in astrocytes. In this project, we hypothesize that miRNAs involve in the multidrug resistance in medically intractable epilepsy by regulating the expression of P-gp. Based on our previous studies, which included in multidrug resistance in refractory epilepsy, the construction of nanoparticles, targeted delivery and release of miRNAs nanoparticles in vivo, we design and establish the current study. This project intends to study miRNAs on multidrug resistance in kindled rats with medically intractable epilepsy. Using miRNAs-microarray, we will screen the miRNAs that regulate P-gp expression in the brain of normal and refractory epileptic rats. These miRNAs will be packaged in nanomaterials and modified by brain targeting molecules, and miRNAs nanoparticles will be delivered to the brain. We will explore the effect of miRNAs nanoparticles on drug resistance in medically intractable epilepsy. The mechanisms by which miRNAs regulate P-gp in epilepsy will also be investigated. This study may provide the foundation for clinical application of miRNAs drugs.

P-糖蛋白（P-gp）为代表的多药转运体参与了难治性癫痫的多药耐药，其作为治疗靶点的外源性药物研究由于明显的毒副作用和缺乏组织特异性而无法应用于临床。因此寻求内源性并具有脑靶向性的调控P-gp的分子，将有助于解决这一难题。前期细胞研究表明microRNAs(miRNAs)作为内源性的小分子RNA可以调控P-gp的表达。因此推测miRNAs可以通过调控P-gp参与了难治性癫痫的耐药。我们在多药转运体参与癫痫耐药以及miRNAs纳米粒子构建和体内靶向递送释放的前期研究为本项目打下了良好的基础。本项目拟在电点燃的难治性癫痫大鼠模型上，采用基因芯片技术筛选出多个调控P-gp表达的miRNAs，利用具有脑靶向作用的分子，制备以调控P-gp表达的miRNAs为核心，纳米材料为载体的靶向药物，观察其对难治性癫痫耐药的影响。探索miRNAs在癫痫耐药中的作用，为miRNAs基因药物的临床应用奠定基础。

癫痫是神经系统的常见疾病，但临床上有约30%的患者对药物不敏感，称之为难治性癫痫。以P-糖蛋白（P-gp）为代表的多药耐药转运体参与了难治性癫痫的多药耐药，以其作为治疗靶点的外源性药物，由于明显的毒副作用以及缺乏组织特异性而无法应用于临床。因此寻求内源性并具有脑靶向的调控P-gp的分子将有助于解决这一难题。MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为20-25 核苷酸的内源性非编码小RNA，主要在转录后水平通过引起目标mRNA的降解或抑制其翻译过程而发挥调控作用，广泛参与癫痫的发生、发展的各个阶段。本课题基于前期细胞研究基础，miRNAs作为内源性的小分子可以调控P-gp表达。我们利用基因芯片在耐药的大鼠微血管内皮细胞中筛选差异表达的miRNAs。并利用生物信息学分析以及细胞验证筛选出多个调控P-gp表达的miRNAs。其次构建以miRNAs为核心，纳米材料为载体，具有脑靶向的药物，研究其对难治性癫痫耐药的影响及其机制。我们采用qPCR、蛋白免疫印迹、荧光素酶报告基因、免疫组化等方法，在体内和体外不同层面阐述miRNAs调控难治性癫痫脑内P-gp的表达，逆转耐药的作用，并且进一步探索了miRNAs作为难治性癫痫患者外周血标志物的可能性。本课题有以下发现：1.在耐药的大鼠脑微血管内皮细胞中miR-446b-1-3p表达降低，而miR-146a-5p表达增高，过表达miR-446b-1-3p和miR-146a-5p均可以抑制P-gp的表达，增加细胞内药物浓度。2.构建以miR-146a-5p为核心，纳米材料为载体，具有脑靶向的纳米粒子；尾静脉注射miR-146a-5p-纳米粒子后，其可以靶向大鼠脑组织，并且可维持约24小时。3. miR-146a-5p-纳米粒子可能通过抑制NF-κB通路下调难治性癫痫大鼠脑内P-gp表达，从而增加脑内AEDs的浓度。4. miR-298可以调控人耐药的微血管内皮细胞上P-gp表达而增加细胞内药物浓度。5.在难治性癫痫患者和药物敏感性患者中筛选出耐药相关的miR-146a-5p和miR-138-5p，评价其作为预测难治性癫痫外周血的生物标记物的可行性。本研究阐明了miRNAs在难治性癫痫中调控P-gp的作用和机制，为miRNAs基因药物治疗难治性癫痫的提供了基础。