亚麻LuMPK2基因的克隆与功能分析

Mitogen activated protein kinase (MAPK), which is located at the lowest level of the MAPKs cascade, plays an important role in plant abiotic stress response. Studies have shown that over-expression of MAPK gene can improve the ability of plant salt tolerance. Our previous studies have found that 20 MAPK genes were predicted from flax genome. Based on the DGE sequencing, microRNA sequencing and degradome sequencing, we found that Lus10013702.g (named LuMPK2) is an important gene for flax to respond to saline-alkaline stress, especially alkaline salt stress. This study intends to clone the LuMPK2 gene and analyzes its expression patterns under different tissues (roots, stems and leave), different hormone treatments (ABA, JA, SA, ET) and different saline-alkaline stresses (neutral salt and alkaline salt ) and its subcellular localization. The over-expression vector will be constructed and transformed into flax. The function of the LuMPK2 gene response to saline-alkaline stress will be verified by some studies on molecular detection (DNA level and RNA level), phenotypic identification (laboratory and saline-alkaline land) and physiological detection (hormone treatments and saline-alkaline stresses) of transgenic plants. This study will provide gene resources and theoretical basis for the cultivation of salt tolerant flax varieties.

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）位于MAPKs级联途径的最下游，在植物非生物胁迫应答过程中发挥重要作用。研究表明，超表达MAPK基因能够提高植物的耐盐能力。申请人前期从亚麻基因组中预测出20个MAPK基因，通过盐碱胁迫下表达谱测序、microRNA测序及降解组测序，发现Lus10013702.g基因（命名为LuMPK2）是亚麻应答盐碱胁迫（尤其是碱性盐胁迫）的重要基因。本项目拟克隆LuMPK2基因，分析其在不同组织部位（根、茎、叶）、不同激素处理（脱落酸、茉莉酸、水杨酸、乙烯）、不同盐碱胁迫（中性盐、碱性盐）下的表达模式及亚细胞定位情况；构建植物过表达载体并转化亚麻，通过对转基因植株进行分子检测（DNA水平、RNA水平）、表型鉴定（实验室、温室、盐碱地）、生理检测（激素处理、盐碱胁迫）等研究，最终阐明LuMPK2基因在亚麻应答盐碱胁迫过程中的功能，为亚麻耐盐碱品种培育提供基因资源和理论依据。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在植物应答非生物胁迫过程中发挥重要作用。研究表明，超表达MAPK基因能够提高植物的耐盐能力。在前期研究工作中，申请人从亚麻基因组中预测出20个MAPK基因，通过盐碱胁迫下表达谱测序、microRNA测序及降解组测序，发现Lus10013702基因（命名为LuMPK2）是亚麻应答盐碱胁迫的重要基因。本项目从盐碱胁迫下的亚麻黑亚19号中，利用PCR技术克隆获得LuMPK2基因。对该基因进行序列分析表明，该基因开放阅读框全长1842bp，共编码了613个氨基酸，是一个碱性亲水蛋白质；该蛋白具有Pkinase结构域，含有多个磷酸化位点，二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主；该基因启动子中含有多个与逆境相关的顺式作用元件；该蛋白与cGMP依赖性蛋白激酶可能存在蛋白互作关系。利用表达谱测序数据分析了该基因的表达模式，结果表明该基因在亚麻根中表达量最高，在叶中表达量最低；在脱落酸、乙烯利和水杨酸处理下表达量随时间先升高后降低，在茉莉酸甲酯处理下表达量先降低后升高，乙烯利处理12小时后表达量增加明显；在盐碱胁迫下，该基因的表达量都有所增加，尤其是在碱性盐胁迫下增加较多；该基因在不同亚麻品种中快速生长期的表达量均高于绿熟期。构建了植物过表达载体，并探索了农杆菌介导法、蘸花法等亚麻遗传转化方法。获得转LuMPK2基因阳性烟草植株。表型鉴定表明，转基因烟草在盐碱胁迫下表现好于野生型烟草，说明LuMPK2基因提高了转基因烟草的耐盐碱能力。转基因植株转录组测序结果表明，大量差异表达基因通过一些特殊的信号通路，参与了转基因烟草应答盐碱胁迫的过程。本项目初步阐明了LuMPK2基因的功能，为亚麻耐盐碱品种培育提供重要基因资源。本项目作为亚麻耐盐碱育种的应用基础研究对培育耐盐碱亚麻新品种具有重要的意义。项目执行期间发表SCI收录论文2篇，还有部分研究结果相关文章正在撰写中。