镉胁迫诱导拟南芥细胞内MLH1和MSH2基因突变及甲基化改变的分子机制

生物体内DNA错配修复（MMR）系统在确保DNA复制的精确性和基因组的完整性等方面发挥重要作用。申请者在前一国家基金中发现，低剂量镉诱导拟南芥细胞内MMR系统中MSH2 和MLH1基因的表达。本项目以铜作为参照污染物，应用前期合成的特异引物和Error-prone PCR等新技术，拟在分子水平上进一步研究镉、铜胁迫对拟南芥细胞内MSH2 和MLH1基因不同突变类型（如错义突变、无义突变、移码突变、沉默突变、剪切突变）以及这些突变与ESEs之间相互作用的影响；探讨2基因启动子部位甲基化状态及甲基化单核苷酸多态性的毒性响应规律；分析2基因的突变频率和表观遗传与镉暴露之间的剂量-效应关系；阐明镉、铜胁迫诱导2基因上述分子行为的不同毒理机制，验证镉的专一性。本研究有望从MMR基因家族中发现镉暴露和效应的特异生物标记物，开发新型DNA分子标记物技术，为我国土壤污染及其修复效果的质量评价提供科学依据。

研究了Cd胁迫下拟南芥幼苗基因组DNA多态性、基因组甲基化以及DNA错配修复基因MLH1启动子甲基化的变化趋势。取得如下研究进展：.建立了一种改进的亚硫酸盐测序技术：基因组DNA经酶切纯化后，用亚硫酸盐修饰液修饰，将MLH1 基因启动子PCR产物克隆、测序后分析表明：与传统亚硫酸盐测序法相比，改进方法有利于DNA完全修饰；明显减少了修饰时间；提高了PCR的特异性、稳定性和重复性。该技术为DNA甲基化分析提供了一种更为理想的研究手段。该方法属于国内首次应用。.采用亚硫酸盐测序技术，分析了Cd 胁迫对拟南芥MLH1 基因启动子甲基化的影响：对405 bp扩增产物克隆测序得知，其含有11 个可发生甲基化的CpG 位点；0-3.0 ppm Cd 处理3 d 后，MLH1 启动子甲基化水平分别为9.1%、18.2%、27.3%、45.5%，且两者呈现出一定的正相关剂量-效应关系，表明MLH1 基因启动子甲基化可作为Cd胁迫的潜在生物标记物。采用亚硫酸盐限制酶技术表明：SalI、TaqI和Hpy99I均能够切割MLH1启动子405 bp片段中的首个CpG位点、亦能够切割405 bp PCR 产物中部分发生甲基化的CpG位点。例如，Hpy99I可以酶切对照405 bp PCR 产物Ibox中的CpG位点，产生353 bp切割片段；而Cd诱导了MLH1启动子区域Ⅱ box内CpG位点甲基化的产生，从而产生353 bp和226 bp切割片段，说明Cd诱导MLH1启动子甲基化水平上调。此研究为国际上该领域内的首次报道。.应用MSAP技术，证实了0-5.0 ppm Cd、Cu处理21天后，幼苗的MSAP比率分别为30.2%、34.7%、41.0%、33.9%、39.2%；甲基化多态性比例分别为2.6%、13.2%、2.4%、11.2%，Cd、Cu处理浓度与DNA甲基化水平和多态性之间呈显著正相关，可作为Cd、Cu胁迫的潜在生物标记物。.幼苗暴露于0–3.0 ppm Cd 26ｄ后，4对RAPD引物扩增出20–23个改变的RAPD片段;其中４个RAPD片段VCR, F-box,RPS3A,PGM与维持基因组稳定性密切相关；而且这些变化与Cd剂量之间存在剂量-效应关系;表明RAPD图谱变化可作为Cd胁迫的潜在生物标记物。此研究为国际上该领域内的首次报道。