基于肠道微生态与代谢组学的藿香正气散改善湿困脾胃证的机制研究

Huoxiangzhengqi powder is the classical prescriptions with treatment of exogenous wind-cold and endogenous damp stagnation, but its mechanism is not fully clear. Using 1H-NMR metabolomics on urine of rats with syndrome of dampness blocking spleen and stomach ,it was found for the first time that compared with the normal group, urine metabolites of model group rats had significant differences and contents of hippuric acid, trimethylamine oxide and dimethylamine were decreased as the main characteristics. These metabolites were significantly related with intestinal flora and symptoms were improved by Huoxiangzhengqi powder. Combining PCR degeneration gradient gel electrophoresis (PCR - DGGE) and 1H-nuclear magnetic resonance (1H-NMR), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) metabolomics , this project tends to study on the effect of Huoxiangzhengqi powder on parts of intestinal microecology and host urine, feces metabolic phenotype in rats with syndrome of dampness blocking spleen and stomach, and through the host metabolic phenotype it was preliminary discussed mechanism of regulation on intestinal microecological of Huoxiangzhengqi powder. It was established corresponding apparent form of syndrome - intestinal flora – biomarkers in order to provide new and more fully experimental basis and theoretical reference revealing its mechanism of treatment in syndrome of dampness blocking spleen and stomach.

藿香正气散是治疗外感风寒，内伤湿滞证的经典方剂，但其作用机制尚未完全清楚。前期基于核磁共振（1H-NMR）代谢组学对湿困脾胃证模型大鼠的尿液进行分析首次发现，与正常组相比，模型组大鼠的尿液代谢物存在显著差异，并以马尿酸、氧化三甲胺、二甲胺含量降低为主要特征，这些代谢物与肠道菌群构成明显相关，且藿香正气散对其有改善作用。本项目拟运用多聚酶链式反应变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）与核磁共振（1H-NMR）、气相色谱-质谱（GC-MS）和超高压液相色谱-质谱（UPLC-Q-TOF/MS）代谢组学相结合的方法研究藿香正气散对湿困脾胃证模型大鼠肠道微生态和宿主尿液、粪便代谢表型的影响，并通过宿主代谢表型初步探讨藿香正气散调控肠道微生态的机制，建立证候-肠道菌群-生物标志物的对应表观形式，以期为揭示其治疗湿困脾胃证的机理提供新的、更为充分的实验依据和理论参考。

藿香正气散是治疗外感风寒，内伤湿滞证的经典方剂，但其作用机制尚未完全清楚。在一般疗效观察确证了其对湿困脾胃证有效性的基础上，本项目拟采用肠道微生态及代谢组学的方法，以16S rRNA高通量测序、1H-NMR和UPLC-QTOF/MS为技术平台，寻找与湿困脾胃证相关的内源性代谢标志物群和差异肠道菌群。利用1H-NMR技术测定大鼠血清、尿液和粪便代谢轮廓，结果表明：藿香正气口服液能有效逆转湿困脾胃证引起的大鼠尿液、血清和粪便代谢表型紊乱，表现为尿液（α-酮戊二酸、二甲胺、肌酐、氧化三甲胺、富马酸），血清（VLDL/LDL、异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、肌酸/磷酸肌酸、氧化三甲胺）和粪便（亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙酸、乙酸、N-乙酰葡糖胺、尿嘧啶、苯丙氨酸）中与湿困脾胃证相关的19个潜在生物标志物产生显著的回调，其代谢通路主要涉及三羧酸循环、脂质代谢、氨基酸代谢及肠道菌群代谢。利用UPLC-QTOF/MS技术在正、负离子模式下测定大鼠血清代谢轮廓，结果表明：在正离子模式下筛选出9个与大鼠湿困脾胃证相关的潜在生物标志物（组胺、谷胱甘肽、鹅去氧胆酸、LysoPE（16：0／0：0）、LysoPC（14：0）、LysoPE（20：3）、L-丝氨酸、N-Acetyglutamine、鞘氨醇），在负离子模式下筛选出6个潜在生物标志物（Cysteine-S-sulfate、脱氧胞苷、S-Methyl-5，-thioadenosine、PS（18：0）、磷酸胆碱、芥酸）。藿香正气口服液能使除L-丝氨酸、N-Acetyglutamine、鞘氨醇、磷酸胆碱、芥酸外的10个潜在生物标志物产生回调。其代谢通路主要涉及氨基酸代谢、胆汁酸代谢、磷脂代谢。此外，基于16S rRNA测序技术，检测到藿香正气口服液能通过增加肠道菌群多样性并改变大鼠库特氏菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、Alistipes 和分节丝状菌的丰度而发挥作用。最终，通过对不同信息的整合分析，本项目建立了证候-肠道菌群-生物标志物的对应表观形式，对于阐释中药经典方剂的作用及机制具有十分重要的意义。