G-四链体交联剂的设计合成及其用于G-四链体相关蛋白的钓取和功能研究

The G-quadruplex, stabilized by Hoogsteen hydrogen bonds, is one of the most important secondary structures of nucleic acids, which always forms in G-rich sequences under some monovalent cations. In recent years, the G-quadruplex has attracted intense interests because of its potential biological functions, such as gene regulation and expression.However, since G-quadruplex structure's polymorphism and variability under complex intracellular conditions, its biological function in cells remains unclear, and even its existance in vivo is always in controversy. To explore the above more deeply, G-quadruplex binding protein and G-quadruplex antibody was essential,including developing more binding proteins and/or antibody and functional study of them. They could be useful tools for G-quadruplex studies. However, up to now, not much G-quadruplex binding proteins have been reported, especially the ones that selectively correlate with different G-quadruplex conformations and/or various important gene sequences. So that capture or pull down G-quadruplex binding proteins of various G-quadruplexs from cells was meaningful and imperitive.Here in this project, we try to use G-quadruplex cross-linking as the strategy to afford various stabilized G-quadruplex, and further use these as tools to pull down their correlated binding proteins.

G-四链体是富含G的序列形成的一种重要的核酸二级结构，其主要分布于原癌基因启动子区及端粒DNA末端突悬处，这种四链体结构的形成被认为具有重要的生物学功能，并且其与肿瘤，衰老等重大生命现象密切相关。近年来，随着一些G-四链体抗体及G-四链体相关蛋白的发展，越来越多的证据显示这种二级结构在体内真实存在，而G-四链体相关蛋白的研究也越来越引起广泛的研究兴趣。G-四链体及其相关蛋白的生物功能研究中，一个主要困难在于G-四链体相比其形成的双链，通常稳定性较差，而且又存在多态性，因此很难控制体内G-四链体结构的形成、稳定及单一构象的锁定。在本课题中，申请人通过设计系列G-四链体交联剂来交联不同构型的G-四链体结构并将其构型锁定，交联剂同时通过生物素标记，将此交联G4体系与细胞内总蛋白作用，然后用链酶亲和素体系钓取与G4有特异性作用的相关蛋白，并进一步研究其性质功能以及与G-四链体的相互作用机制。

摘要 G-四链核酸是特殊二级结构核酸中的一个重要成员，它对于核酸的生物功能乃至于整个基因表达过程都具有十分深远的影响。从基因组的复制、端粒的稳定性、到转录调控、信使RNA的成熟、以至于翻译调控等等，G-四链结构动态调控所介导的调控机制广泛深远的存在并影响着上述诸多生命过程。因此，在G-四链结构发现至今的几十年里，研究者们围绕G-四链核酸，展开了广泛又深入的研究。目前，体外研究已经相对发展完善，从结构解析到配体分子的开发，都积累了大量有利的经验。然而，难点始终是细胞内环境下的研究，包括这个特殊四链结构的形成、稳定性、动态过程、调控机制、相关蛋白等等系列命题都存在很大的研究空间，目前众多问题也都有争论存在，这主要是由于G-四链结构自身的动态可变性导致的，其不同构象间的可变性及四链结构与解旋状态间的可变性，带来了更多的复杂性与研究的困难。同时，正是由于G-四链结构的可变与可调控性，其在生命过程中往往就是通过结构的动态变化，来实现对多种复杂过程的平衡调控，而与之相互作用的功能性蛋白成为一类重要的作用靶标。G-四链结构通过动态变化，往往可以导致与之相关的蛋白的变化，进而介导相关生命过程的调控。因此，G-四链相关蛋白的研究成为揭示G-四链核酸生物功能的重要突破点。本项目发展了基于交联策略的G-四链结构小分子探针，通过引入与G-四链结构产生共价相互作用的小分子，来固定细胞中动态形成的G-四链结构，解决目标G-四链核酸结构控制的问题；在此基础上，在小分子探针上引入亲和富集基团，用于钓取与G-四链核酸相互作用的蛋白。通过本项目的研究，成功发展了一个能用于蛋白钓取的G-四链小分子交联探针，钓取得到了数个与G-四链结构相关的蛋白，并分析和验证了其中最重要的一个蛋白。与此同时，项目承担人也对G-四链结构小分子探针进行了新的拓展，发展了新的应用。