骨髓间充质干细胞肝内移植分化为肝细胞的活体基因显像研究

在分子水平检测及显示骨髓间充质干细胞（MSCs）在活体肝内分化为肝细胞是阐明MSCs移植治疗终末期肝病的关键环节，这也是干细胞移植基础与临床研究面临的难题。本课题构建同时含有荧光蛋白（mRFP）、萤光素酶（mtFluc）和铁蛋白（FT）为报告基因的慢病毒FUGW-Ubiquitin-mRFP-mtFluc-FT和FUGW-Alb E/P-mRFP-mtFluc-FT，分别感染大鼠MSCs，将所携带基因整合到MSCs基因组中，在启动子Ubiquitin驱动下mRFP、mtFluc、FT组成性表达，而在白蛋白增强子/启动子（Alb E/P）驱动下三个基因只能在MSCs分化为肝细胞时才特异表达；将感染慢病毒的MSCs，分别移植肝纤维化大鼠肝内；利用生物发光成像、MR成像和荧光显像，在活体和离体下同步检测MSCs分布、增殖和分化为肝细胞的过程。本研究结果为澄清MSCs移植修复肝脏机制提供客观依据。

骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗终末期肝病，究竟MSCs能否在受损的肝脏增殖、分化为肝细胞或有肝细胞功能的肝样细胞，发挥其修复肝脏的作用，目前尚缺乏直接、客观的证据，同时也存在较大争议。本课题利用基因显像方法（慢病毒和多功能纳米载体转染）示踪MSCs在活体肝内增殖、分化的过程，为澄清MSCs移植修复肝脏的机制提供证据。首先我们成功构建了包含多模态基因显像的两个慢病毒载体，一是构建了同时含有红色荧光蛋白（mKate2）和荧光素酶（luc2）为报告基因的慢病毒载体（pLenti6.3-CMV-luc2-mKate2），二是构建了白蛋白增强子/启动子（Alb E/P）驱动下的同时含有绿色荧光蛋白（EGFP）、荧光素酶（luc2）和储铁蛋白（ferritin）为报告基因的慢病毒载体（pLenti7.3-Alb E/P-ferritin-IRES-luc2-SV40-EGFP）。前者用于移植的MSCs在肝内分布和增殖的示踪，后者用于MSCs移植后分化为肝细胞的监测。两个慢病毒载体，分别感染人MSCs，将所携带的基因整合到人MSCs基因组中。本研究证实了同时包含上述荧光、生物发光和MR成像的三种显像方法示踪MSCs的可行性，可用于MSCs移植活体动态示踪研究。转染的人MSCs可成功诱导分化为骨细胞、脂肪细胞，说明慢病毒导入MSCs后，对MSCs分化特性无影响。除上述慢病毒转染基因显像外，我们还进行了多功能纳米载体（scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION）在MSCs基因转染及磁共振显像中的应用研究。在JO2诱导的小鼠急性肝损伤模型的活体研究中，我们应用上述基因显像方法，证实经肠系膜上静脉移植（门静脉途径）为最优的MSCs移植途径，每次最理想的移植细胞数量为2.5~5×105。在非糖尿病严重联合免疫缺陷小鼠（NOD-SCID）急性肝损伤模型中，经肠系膜上静脉移植永生化人MSCs，发现MSCs在NOD-SCID小鼠肝内增殖，并导致严重肝纤维化；进一步应用ALU探针和红色荧光二抗的荧光原位杂交实验，证实肝内成纤维样细胞来源于移植的MSCs。本研究建立了多种成像策略协同下的基因显像方法，同时也使我们重新认识MSCs修复肝脏的机制，对MSCs移植治疗肝损伤的临床应用需更加谨慎，还需进一步深入研究。