miR-139 在奶牛乳腺发育及泌乳中的作用机制研究

microRNAs(miRNA) are confirmed to be important in many life process. But the roles of miRNAs in dairy cow mammary gland are not clear. Herein we construct miR-139 target gene library by using RIP and microarray, and then we focus on the roles of miR-139 on dairy cow mammary gland development and lactation,analyse their target genes in cow mammary gland development with bioinformation. By in vitro experiments to investigate the role of miR-139 in dairy cow mammary gland development and lactation.Our data enhance understanding the functions of miRNAs on mammary gland development and lactation.

miRNA作为表观遗传学成员越来越被关注，但目前miRNA在奶牛乳腺发育和泌乳中的表观调控作用及机理知之尚少。本研究采用RNA免疫共沉淀、基因芯片等生物学技术，检测miR-139 在奶牛乳腺上皮细胞中调节的靶基因；应用miR-139 超表达子及 miR-139 抑制子，转染奶牛乳腺上皮细胞，结合免疫印迹、激光共聚焦显微镜等技术确定miR-139在奶牛乳腺发育及泌乳过程中的调节作用；阐明miR-139 在奶牛乳腺发育及泌乳过程中的靶基因及其作用机理；观测miR-139 调节奶牛乳腺发育及泌乳过程中的生物效应，建立研究miRNA调控泌乳的生物学新方法、新理论。

miRNAs能参与生物体的多项生理活动。目前miR-139在健康乳腺中的作用还属未知。本研究利RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）-seq技术，鉴定出miR-139在奶牛乳腺上皮细胞中共有883个靶基因，KEGG分析得到22条显著性富集的通路；GO分析发现，涉及生物学功能著性GO term 191个；涉及细胞过程功能显著性GO term 60个；涉及分子组成功能显著性GO term 52个。.随后，我们发现与妊娠中期奶牛乳腺组织相比，miR-139在泌乳中期奶牛乳腺组织中表达下调。我们接下来选择miR-139在奶牛中的2个靶基因，生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）和I型胰岛素样生长因子受体（type I insulin-like growth factor receptor，IGF1R）进行下一步研究。双荧光素酶实验结果表明，miR-139直接结合在GHR和IGF1R的3' 非编码区。另外，miR-139过表达或沉寂能影响GHR 和IGF1R在奶牛乳腺上皮细胞中的mRNA表达；miR-139过表达显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞的活力、增殖能力以及β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的合成；miR-139沉寂实验则表现出相反结果；miR-139过表达能显著下调奶牛乳腺上皮细胞中GHR、IGF-IR、STAT5、p-STAT5、PPARγ、SREBP1、Cyclin D1、p-70S6K、p-p70S6K、AKT1、p-AKT1、mTOR、p-mTOR的表达；miR-139沉寂实验则表现出相反结果，说明miR-139能通过调节其靶基因GHR和IGF-IR进而调节泌乳相关信号通路蛋白的表达；最后，miR-139和GHR共抑制组与GHR沉寂组相比，GHR、IGF-IR、AKT1、p-AKT1以及酪蛋白的表达量显著上调；而miR-139和GHR基因共抑制组与miR-139沉寂组相比，GHR、IGF-IR、AKT1、p-AKT1以及酪蛋白的表达量显著下调，这一结果一方面再次验证了GHR是miR-139的靶基因；另一方面说明miR-139的另一个靶基因IGF-IR的表达和作用还受到GHR的调节。.综上所述，本项目将为今后进一步研究miRNA对乳腺的发育及泌乳功能调节奠定重要的理论和实验基础，所采取的方法适用于其它miRNA在乳腺中的靶基因鉴定、验证及功能分析。