参与胸腺素β4对内皮祖细胞旁分泌作用调控的microRNA和信号转导机制研究

Based on our previous study results that thymosin β4 (Tβ4) can improve endothelial progenitor cells (EPC) number and function in vitro, this project aims to further study the effect of Tβ4 on EPC paracrine effects both in vivo and vitro. To clarify the mechanism, we observe the effects of Tβ4 on PTEN/PI3K/Akt/eNOS signaling pathway and the expression and secretion of EPC cytokines including IL-8, VEGF, and so on. To identify the roles of IL-8, VEGF,and PTEN/PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in this process, neutralizing antibody used to antagonize the effects of IL-8 and/or VEGF, specific chemical inhibitors and siRNA used to inhibit the activation of Akt, eNOS. In addition, we will examine the effect of Tβ4 intervention on the expression of microRNA in EPC, and filter out microRNAs that may be associated with EPC paracrine effects. Finally, we try to explore the possible relationship between microRNA and the PTEN/PI3K/Akt/eNOS signal transduction pathway. This study will demonstrate the effect and mechanism of Tβ4 on EPC paracrine effects, may provide theoretical basis for further understand about the physiological effect and possible mechanism of Tβ4, and also provide new treatment strategies and targets for EPCs therapy in ischemic cardiovascular diseases.

本项目拟在前期Tβ4对EPC数量和功能影响的研究基础上，观察Tβ4体、内外干预对EPC旁分泌作用的影响。为明确其机制，先后观察Tβ4对EPC内IL-8、VEGF等细胞因子表达和分泌，以及PTEN/PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响。然后采用中和性抗体拮抗IL-8、VEGF的作用，采用化学抑制剂及siRNA抑制Akt、eNOS的激活，进一步明确IL-8、VEGF和PTEN/PI3K/Akt/eNOS信号通路在其中的作用；此外，拟观察Tβ4干预对EPC内microRNA表达的影响，并筛选出可能与EPC旁分泌相关的microRNA。最后观察microRNA与PTEN/PI3K/Akt/eNOS信号通路之间的相互关系。该研究对于深入系统的阐明Tβ4对EPC旁分泌的影响及机制，为进一步认识Tβ4的生理效应及其可能机制提供理论依据, 并为EPC治疗缺血性心血管疾病提供了新的治疗策略和靶点。

本团队既往研究发现胸腺素β4（thymosin β4, Tβ4）可促进内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）迁移、抑制其凋亡。但是，Tβ4是否可以促进EPC的旁分泌作用和相关的机制目前尚未可知。为此，我们在原有研究基础上，进一步研究Tβ4对EPC的旁分泌作用，并利用化学抑制剂及siRNA分别抑制ILK、Akt和eNOS的活性，观察ILK/Akt/eNOS信号通路是否介导Tβ4对于EPC的促旁分泌作用。此外，筛查了可能参与调控Tβ4上述作用的MicroRNA。在本项研究中，我们发现Tβ4干预能明显增加EPCs内和EPCs-CM中VEGF和IL-8的表达，EPCs-CM能够显著增加内皮细胞迁移和成血管作用，Tβ4干预能进一步增强EPCs-CM对内皮功能的影响，而VEGF和IL-8的中和性抗体可以分别拮抗Tβ4对EPCs-CM促内皮迁移和成血管的增强效应。Akt siRNA可以显著降低Tβ4-EPCs-CM中VEGF和IL-8的表达；eNOS siRNA可以显著降低Tβ4-EPCs-CM中VEGF而非IL-8的表达。这表明Tβ4能够促进EPCs的旁分泌作用，增加EPCs内和EPCs-CM中VEGF和IL-8的表达，且这一作用与Akt/eNOS信号转导途径有关。此次实验结果为深入系统地阐明Tβ4对旁分泌作用的影响及机制，将为进一步认识Tβ4的生理效应及其部分可能机制提供理论依据从而进一步为优化EPC移植治疗心血管病提供理论依据和策略。