基于红外光谱研究染色质重塑中的DNA构象转变

Chromatin remodeling is one of important topics in epigenetics, which includes the type of histone covalent modification and the type of ATP dependent remodeling. The change of interaction between histone and DNA during chromatin remodeling may also induce DNA conformation change. Recently, we have found that histone acetylation elevation can indeed lead to B-Z conformational transition of DNA. However, the mechanism for this B-Z conformational transition remains elusive. In addition, whether there is correlation between the ATP dependent chromatin remodeling and DNA conformation is also worth exploring. Modern infrared spectroscopy technology can now provide an effective tool for tackling this problem. The subtle spectral change of the fingerprint bands attributed to the DNA conformation change can be analyzed quantitatively through spectral data processing. Therefore, this project aims to address this issue which concerns the DNA conformation change either due to histone acetylation modification or ATP-dependent chromatin remodeling, and we will employ Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy to detect and analyze DNA conformation without destroying cell structure under both promoting and inhibiting chromatin remodeling conditions, so as to investigate the possible regulations and underlying mechanisms for the changes.

染色质重塑是表观遗传学的主要研究内容之一，包括组蛋白共价修饰型与ATP依赖型两种类型。当染色质发生重塑时，组蛋白与DNA间的相互作用将发生改变，由此推测DNA构象可能发生变化。最近，我们研究发现，伴随组蛋白乙酰化程度增加确实导致DNA发生B-Z构象转变。但是，引起这种DNA的B-Z构象转变原因仍不清楚。另外，ATP依赖型的染色质重塑与DNA构象间是否同样存在相关性，这也值得探讨和研究。现代红外光谱技术可为研究此问题提供一种有效的探测和分析工具。当细胞内DNA构象发生变化时,其光谱指纹图谱也将发生细微改变，经光谱数据处理，可定量分析细胞中的DNA构象变化。为此，本项目拟从组蛋白乙酰化修饰型与ATP依赖型两种染色质重塑类型着手，分别在促进和抑制染色质重塑的条件下，应用傅里叶变换红外光谱技术，在不破坏细胞完整性的条件下对细胞内DNA构象进行定量分析，由此探索染色质重塑中的DNA构象变化及其规律。

染色质重塑是表观遗传学的主要研究内容之一，包括组蛋白共价修饰型与ATP依赖型两种类型。当染色质发生重塑时，组蛋白与DNA间的相互作用将发生改变，推测DNA构象可能发生变化。但是，要在细胞水平直接观测DNA的构象变化，这在目前仍是一个挑战。红外光谱技术可为研究此问题提供一种有效的分析工具，当细胞内DNA发生变化时，光谱指纹图谱也将发生细微改变。据此，本项目采集细胞的傅里叶变换红外（FTIR）光谱，建立光谱拟合方法，用于分析染色质重塑中的Z-DNA含量变化，进而阐明染色质重塑与DNA构象转变之间的关系。具体内容如下：.1）组蛋白乙酰化修饰型染色质重塑。采用组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（HDACi）代表药物曲古菌素 A（Trichostatin A：TSA）作用细胞，提高组蛋白的乙酰化水平。然后采集TSA处理后的细胞红外光谱，光谱拟合处理，分析细胞内的Z-DNA含量变化。结果显示：细胞乙酰化水平越高，Z-DNA的含量就越多，该变化可以通过红外光谱进行表征。.2）ATP依赖型染色质重塑。SWI/SNF复合体能利用催化亚基BRG1或者BRM水解ATP产生能量动员核小体，重构染色质。本研究分别沉默和过表达BRG1/BRM基因，通过荧光定量PCR和western blotting证明基因的沉默/过表达成功，进而在抑制/促进染色质重塑的条件下，采集细胞红外光谱，分析细胞中的DNA构象变化规律。结果显示：当BRG1或BRM基因沉默时，Z-DNA含量降低，而当BRG1或BRM过表达时，Z-DNA含量增加。结论：ATP依赖型染色质重塑中存在DNA的构象转变，并可以通过红外光谱进行表征。.3）红外光谱表征结果验证。Western blotting分析显示：Z-DNA结合蛋白ADAR1和ZBP1的含量伴随BRG1/BRM的沉默或过表达而改变，即干扰BRG1/BRM导致ADAR1和ZBP1的表达减少；而过表达BRG1/BRM则导致ADAR1和ZBP1的表达增多，间接说明了Z-DNA含量的减少或增加, 佐证了光谱的表征结果；另外染色质免疫共沉淀(ChIP)分析显示：细胞中ADAR1及与ADAR1稳定结合的Z-DNA随BRG1/BRM的沉默或过表达确实发生降低或增加，进一步佐证了红外光谱表征Z-DNA构象的可靠性。