益气活血方活性组分抑制糖尿病仓鼠心肌病心室重塑及细胞凋亡的机制

糖尿病心脏病是糖尿病人的首位死因。近期研究表明，心肌纤维化、心室重塑及心肌细胞凋亡是病变关键，尤其是心肌细胞功能与数量的改变。我们前期临床研究结果:该病1274例患者中,气虚血瘀证占73%，生脉散和丹参饮合用最多；我们经实验证实,益气活血法（生脉散丹参饮合方）有显著抗糖尿病大鼠心肌纤维化作用。本课题拟在以往益气活血法抗糖尿病心肌纤维化研究的基础上，以糖尿病仓鼠为研究模型，研究第8周至12周心肌组织胶原含量和比值动态变化、心肌细胞凋亡数目和凋亡指数、心肌细胞AT2和Bcl-2蛋白等表达量的变化。与抗氧化剂氨基胍、血管紧张素II受体拮抗剂坎地沙坦对照，近一步证实益气活血方抗心肌细胞凋亡及心室重塑的发生和发展，减少细胞丢失的作用。用已知益气活血方的有效组分或成分，采用均匀设计、回归分析方法，获得基于组分配伍的"最佳配方"，借以探讨益气活血方药防治糖尿病心肌病的机理和有效靶点。

探讨生脉饮、丹参饮、生脉饮+丹参饮抗糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化作用，与益气、活血、益气活血治则对应的最佳组分配伍。（一）生脉散抑制高糖环境心肌细胞凋亡分子机制。目的：生脉散水提物及单体对高糖环境下H9c2心肌细胞抗凋亡作用及机制。方法：采用大鼠采含药血清，对正常和高糖环境H9c2心肌细胞干预，MTT法筛选配方最佳浓度，细胞存活率判定对心肌细胞保护。乳鼠心肌细胞培养后分为对照组、模型组，水提物高中低组、单体高中低组。流式细胞仪测心肌细胞凋亡率；Western-blot测药物对p53、Bcl-2和Bax蛋白表达；Q-PCR检测Fas和Fas-L mRNA转录量。结果：高糖环境下中药提高心肌细胞成活率，与药液浓度正相关。与模型组比较，中药组能减少心肌细胞内Bcl-2含量, 增加Bax和p53的含量。结论：生脉散能保护高糖环境下H9c2心肌细胞损伤，有效抑制心肌细胞凋亡。（二）丹参饮抗糖尿病心肌病大鼠心肌纤维化分子机制：目的：丹参饮对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌成纤维细胞（CFs）纤维化影响及机制。方法：AngⅡ诱导糖尿病心肌纤维化细胞模型随机分10组：正常对照组、AngⅡ组、AngII+氨基胍组、AngII+坎地沙坦组、AngII+高中低6剂量组。采用Western Blot印迹方法、ElISA检测I型胶原蛋白、III型胶原蛋白表达水平。结果：与模型组比较，组分和水煎剂各组均能明显抑制AngⅡ诱导的CFs增殖，随着剂量的减少，心肌成纤维细胞的增殖逐渐增加。中药各组抑制AngⅡ诱导CFs中的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白表达。结论：丹参饮抑制AngⅡ诱导CFs增殖和降低I型胶原蛋白、III型胶原蛋白的表达水平，抑制心肌纤维化。（三）基于均匀设计抗糖尿病心肌纤维化中药有效组分处方优化：目的：确定本复方抗糖尿病心肌纤维化最佳组分配伍。方法：采用均匀设计 “6因子12水平表”，逐步回归获得“最佳配方”。结果：心肌Ⅲ型胶原含量为因变量，最佳配比为麦冬多糖300mg,檀香油10mg,五味子油0.25mg,丹参酮IIA5mg。AI为因变量，最佳配比人参总皂苷200mg，五味子油1mg，檀香油0mg，乙酸龙脑酯0mg。Bcl-2/Bax比值为因变量，最佳配比为麦冬多糖300mg，檀香油10mg。结论：各组分配伍能抗糖尿病大鼠心肌纤维化，主效应药物因不同病理机制而异。