蓝藻发菜光形态建成过程中MAAs的合成调控与功能研究

蓝藻发菜是我国一级保护野生植物，近年来其人工培养一直没有取得理想进展，而大肆盲目搂采野生发菜却使我国草原生态环境遭到严重破坏。在前期工作中，我们发现低剂量UV-B介导发菜的光形态建成，而天然防晒物质类菌孢素氨基酸（MAAs）在此过程中可能扮演重要角色，并首次从单根藻丝培养出似自然状态的发菜原植体。本项目拟在前期工作基础上，研究发菜MAAs合成与UV-B间的相关性，鉴定发菜MAAs合成相关基因的功能；通过酵母单杂交筛选调控MAAs合成的转录因子，揭示UV-B对MAAs合成的分子调控机制；通过基因敲除和超表达技术，并结合MAAs合成途径的抑制剂，分析突变株、超表达株和野生型发菜的光形态建成、胶质鞘结构和生理特性，阐明MAAs在发菜光形态建成过程中的功能。本研究将拓展和深化人们对低剂量UV-B介导的光形态建成机制的认识，为发展发菜的人工培养技术提供理论基础，从而有效促进我国发菜资源的保护和利用。

蓝藻发菜是我国一级保护植物，主要生长在干旱、半干旱的荒漠地区，对干旱、紫外线等逆境具有极强的耐受能力。研究发现，发菜的天然防晒物质类菌胞素氨基酸（Mycosporine-like amino acids, MAAs）对UV-B表现出独特的响应机制。..我们首先克隆了发菜的五个MAAs合成酶基因，分别在模式蓝藻Nostoc sp. PCC 7120中异源表达，通过鉴定合成产物揭示各基因的功能，阐明了发菜MAAs的合成途径。随后，研究了发菜MAAs合成酶基因表达与UV-B间的关系，发现随着UV-B处理时间的增加，这些基因及其表达产物的表达水平都显著上调。通过启动子逐段缺失，并连接LuxAB报告基因的方法，确定了MAAs合成酶基因受UV-B调节的关键启动子活性区域。以该活性区域为诱饵，利用DNA-蛋白亲和实验，调出了与之相互作用的转录因子ORF4233，EMSA和酵母单杂交实验进一步验证了ORF4233与MAAs合成酶基因启动子的结合。同时，获得了ORF4223超表达的发菜转基因藻株，并对其进行表型测定，证实MAAs合成可增强藻细胞对UV-B的耐受能力。进一步以ORF4233为诱饵，通过免疫共沉淀，调出与ORF4233相互作用的蛋白ORF5811，体外Pull-down实验以及酵母双杂交实验，进一步验证了这两个蛋白的相互作用。蛋白ORF5811具有蓝藻光敏色素的GAF典型结构域，可能在发菜响应UV-B调控MAAS合成过程中行使光受体功能。..转录因子ORF4233 的表达受UV-B 诱导，我们获得了ORF4223 超表达的发菜转基因藻株，发现MAAs 合成可增强藻细胞对UV-B 的耐受能力。通过室内人工添加低剂量UVB辐射，同时借助在蓝藻转化子筛选过程中所使用的纤维酯膜与固体平板体系，在固体培养条件下有效地实现了干湿交替处理，在无菌条件下从单根藻丝培养出似自然状态的发菜原植体。同时，我们发现低剂量UV-B诱导类菌孢素氨基酸的含量显著升高，促进藻丝体外胶质鞘的形成，使得藻丝在胶质鞘内趋于规则排列。