厚壳贻贝甲腺原氨酸脱碘酶基因调控幼虫变态的分子机理研究

The larval metamorphosis process is a critical period for determining success rate of artificial breeding in the mussel Mytilus Coruscus. Iodothyronine deiodinase is an important factor in thyroid hormone signaling pathway. Two iodothyronine deiodinase genes have been identified from the transcriptome data of Mytilus Coruscus. The full length of the iodothyronine deiodinase gene will be obtained by RACE technology and the gene structure is analyzed by bioinformatics. The expression pattern of iodothyronine deiodinase gene during larval metamorphosis will be analyzed by quantitative PCR, in situ hybridization and Western blot. The RNA interference will be used to identify the gene function. The effect of the thyroid function inhibitors on the growth and metamorphosis of mussel larvae was also studied. The present study based on vertebrate model for elucidating the molecular endocrinology mechanisms underlying larval metamorphosis will contribute to improve larval metamorphosis rate and reproduction rate and provide the theoretical guidance for promoting shellfish aquaculture industry.

厚壳贻贝幼虫的附着变态过程是苗种培育的关键时期。甲腺原氨酸脱碘酶是甲状腺素信号通路的重要调控因子。本研究采用比较转录组分析筛选出与厚壳贻贝幼虫变态相关的2个甲腺原氨酸脱碘酶基因，利用RACE技术并结合生物信息学方法分析甲腺原氨酸脱碘酶基因的结构特征；采用荧光定量PCR、原位杂交和Western blot研究甲腺原氨酸脱碘酶基因在幼虫变态过程中的表达模式，结合RNA干扰技术解析其生物学功能；利用甲状腺功能抑制剂研究其对厚壳贻贝幼虫生长和变态的影响。本研究以脊椎动物甲状腺信号通路调控变态发育模型为依据，开展厚壳贻贝幼虫变态发育的分子内分泌调控机理研究，为提高厚壳贻贝变态成功率和繁殖率提供技术支撑，进而为推动贝类增养殖产业发展提供理论依据。

厚壳贻贝幼虫的附着变态过程是苗种培育的一个关键阶段，也是幼虫向成体转变的重要必经阶段。甲腺原氨酸脱碘酶是甲状腺素信号通路的重要调控因子。本实验室前期从双壳类厚壳贻贝（Mytilus coruscus；Mc）中克隆得到两个脱碘酶基因（McDx和McDy）全长。系统发育分析表明软体动物（McDy、CgDx和CgDy）脱碘酶序列与脊椎动物的（D2和D3）具有较高的相似性。qRT-PCR显示McDx和McDy的表达量随幼虫的个体发育显著上升。利用整体原位杂交方法研究了McDx和McDy基因在厚壳贻贝幼虫各发育阶段的时空表达。结果显示：在担轮幼虫时期，McDx和McDy都表达在端毛轮和环毛轮，McDx同时在壳区域也有表达。在D形幼虫时期，McDx和McDy表达在外套膜区域，表明主要与壳的生成相关。在壳顶幼虫和眼点幼虫时期，McDx和McDy在胃肠区域都有表达。值得注意的是，McDx在眼点幼虫脑神经节、足神经节和内脏神经节也有表达，表明其对神经节发育具有重要作用。为研究厚壳贻贝脱碘酶基因在幼虫变态发育过程中的作用，采用siRNA电转染技术分别敲降了McDx和McDy基因的表达，qPCR结果显示McDx和McDy基因的表达量较对照组显著下降（P < 0.05），且敲降后幼虫变态率与对照相比显著下降(P < 0.05)。同时，利用甲状腺功能抑制剂巯咪唑（Methimazole）、三碘氨苯乙丙酸（Iopanoic acid）和丙硫氧嘧啶（Propylthiouracil）研究了其对厚壳贻贝幼虫变态和稚贝生长的影响，结果表明MMI、IOP和PTU都显著抑制了厚壳贻贝幼虫的变态（P < 0.05）。且稚贝经MMI暴露4周后，其生长受到显著抑制（P < 0.05）。这表明了厚壳贻贝幼虫变态和发育的影响可能是通过贻贝体内的激素信号来实现的。这对探索变态的起源和进化具有重要意义。本研究揭示了厚壳贻贝脱碘酶基因参与了幼虫的生长和变态发育，为研究贝类幼虫变态的分子机制提供数据支撑, 进而为推动贝类增养殖产业发展提供理论依据。