咪唑类离子液体对嗜热酯酶EST10分子构象及催化立体选择性的影响机制

Ionic liquid is as biocatalytic reaction solvents or co-solvents and important changes on biocatalytic behavior and molecular conformation of the enzyme in it take place, but the effect mechanisms and the rules are still unclear. In this study, the stereoselective resolution (R, S)-ketoprofen ethyl ester catalyzed by the thermophilic esterase EST10 in imidazolium-based ionic liquid will be as a model reaction, and detailed studys on the stereoselectivity, reaction kinectics, thermodynamics of enzymatic structure and molecular conformation of EST10 in ionic liquid will be carried out by isothermal titration calorimetry, fourier transform infared spectroscopy, size exclusion chromatography coupled with muti-angle static laser light scattering system, circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The relations between catalytic stereoselectivity and molecular conformation of EST10 in imidazolium-based ionic liquid will be established, and the regulation method of the stereoselectivity in ionic liquid will be put forward. These results will clarify the effect mechanisms of ionic liquid on enzymatic stereoselectivity and molecular conformation, and mechanisms of catalytic stereoselectivity of the enzyme. The research will be expected to contribute to understand the interaction between ionic liquid and enzyme and scientific laws of reaction medium on the enzyme, and expand the application of ionic liquid as a new green reaction medium in the enzymatic reactions of chiral resolution.

离子液体作为生物催化反应的溶剂或共溶剂，酶在其中的生物催化行为和分子构象发生重要变化，而离子溶液影响规律和机制至今还不清楚。本课题以嗜热酯酶EST10在咪唑类离子液体中立体选择性拆分(R,S)-酮洛芬乙酸酯作为模型反应，拟利用等热滴定微量仪、傅里叶变换红外光谱、多角度激光光散射凝胶色谱系统、圆二色谱和荧光光谱等技术手段研究不同咪唑类离子溶液中嗜热酯酶EST10立体选择性、反应动力学、酶结构热力学和分子构象变化，建立离子液体中嗜热酯酶EST10分子构象和催化立体选择性之间的关系，提出酶在离子溶液中催化立体选择性的调控方法，在此基础上阐明离子液体作为反应介质影响酶分子构象和催化立体选择性的作用机制以及酶催化立体选择性作用机理等基础科学问题。本研究预期将有助于理解离子液体和酶之间的相互作用，深化认识反应介质对酶影响的科学规律，同时拓展了离子液体作为新型绿色反应介质在酶促手性拆分反应中的应用。

离子液体作为生物催化反应的溶剂或共溶剂，酶在其中的生物催化行为和分子构象发生重要变化，其中酶分子构象转变是生物催化性质发生变化的重要原因。本课题利用基因工程方法建立了嗜热酯酶EST10在大肠杆菌中表达、纯化与制备的方法，并检测到酯酶EST10具有水解(R,S)-酮洛芬乙酯生成(S)-酮洛芬的活性；运用UPLC研究了酯酶EST10在21种不同属性的离子液体中催化立体选择性（底物转化率、产物对映体过量和酶对映选择率），确立离子液体[OmPy][BF4] 作为该反应的最佳反应介质；利用等温滴定量热仪（ITC）研究酯酶EST10与离子液体[OmPy][BF4]相互作用，测定酯酶EST10催化反应过程中结合位点数和结合常数，建立了酯酶EST10分子构象变化的两点结合热力学模型，证实酯酶EST10与离子液体[OmPy][BF4]相互作用过程中静电及氢键的作用大于疏水作用；酯酶EST10以(R,S)-酮洛芬乙酯和水为底物，生成(S)-酮洛芬，该反应过程属于双底物乒乓催化反应机制，利用King-Altman 方法推导动力学反应方程，并通过实验数据验证了该模型的真实可信度；通过圆二色谱测定酯酶EST10在不同咪唑类离子液体中的分子构象变化，发现发现了离子液体中酯酶EST10的α-螺旋与β-折叠含量与酶催化立体选择性对应关系。优化了酯酶EST10离子液体[OmPy][BF4]中水解反应条件，(R,S)-酮洛芬乙酯 150 mM，反应时间10 h、反应温度75℃、酶浓度为15 mg/mL，酯酶EST10的底物转化率、产物对映体过量和酶对映选择率分别为47.4%、96.6%和177.0。