Gpc-1在低温机械灌注改善DCD供肾血管痉挛中的作用及机制

The shortage of donors increases the usage of kidneys from donation after cardiac death (DCD), while the rate of delayed graft function (DGF) is up to 40%-90% among DCD kidney recipients. The previous research in our center demonstrated that hypothermic machine perfusion (HMP) could significantly reduce the rate of DGF from 33.3% by static cold storage to 21.9% mainly through alleviating vasospasm, but the molecular mechanisms are not unknown. Further studies showed that the expressions of Kruppel-like factor 2 (KLF2), Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and Glypican-1 (Gpc-1) greatly increased in HMP group. We innovatively speculated that HMP could stimulate the KLF2/eNOS signaling pathway through Gpc-1, a mechanical stress sensor located on the membrane of vascular endothelial cells, so as to ultimately alleviate the vasospasm and improve the quality of kidney from DCD. We intend to use the Entranster-in vivo transfection technique and the genome editing technique to control Gpc-1 expression on animal models and human renal artery endothelial cells respectively and observe the effect of any changes in Gpc-1 expression on the KLF2/eNOS signaling pathway to investigate the molecular mechanism behind vasospasm mitigation by HMP, with the aim to offer new targets for further improving the quality of kidney from DCD and optimizing the perfusate.

供肾缺乏促使心脏死亡供体（DCD）应用增加，但术后肾功能延迟恢复（DGF）发生率高达40％-90％。我们前期研究证实低温机械灌注（HMP）主要通过减轻血管痉挛明显降低DGF发生率（从静态冷储33.3%下降至21.9%），但分子机制不明。进一步研究显示，HMP组Kruppel样因子2（KLF2）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（Gpc-1）表达显著增加。由此我们推测HMP通过Gpc-1（血管内皮机械应力传感器）激活KLF2/eNOS通路，从而减轻血管痉挛，改善DCD供肾质量。我们拟采用Entranster-in vivo转染技术及基因编辑技术分别在动物模型及人肾动脉内皮细胞中调控Gpc-1的表达，观察Gpc-1的变化对KLF2/eNOS信号通路的影响，明确HMP改善血管痉挛的分子机制，以期为DCD供肾质量进一步修复、机械灌注液的优化提供新靶点。

在肾移植（KT）中,肾脏缺血再灌注损伤（ IRI）是一个无法避免的过程。IRI常常会诱发肾小管上皮细胞脱落，使尿液中液体和溶质的吸收和排泄功能失调，导致移植术后发生肾功能延迟恢复（DGF），严重影响移植受者的预后。另外，由于供体肾脏严重缺乏，导致边缘供体应用于临床，相较于标准供体而言，边缘供体肾脏经历更严重的IRI。为此，本课题从肾脏IRI的机制出发，通过低温机械灌注（HMP）修复边缘供肾及研究潜在机制，为肾移植的预后提供可靠的理论依据。主要内容包括：高通量筛选的IRI显著性高表达基因MMP9与SPP1在肾脏IRI中具体作用机制；HMP对供体肾脏保护效果及添加线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）的激动剂alda-1对供肾的修复作用及相关机制。研究结果显示，在肾脏IRI中，肾小管细胞内积聚的活性氧自由基（ROS）表达增多，同时MMP7和SPP1显著高表达并伴随着肾小管细胞表面蛋白SDC1和细胞连接蛋白TJP1显著降低。另外随着复氧的时间增加MMP2和MMP9表达也随时间延长而增加。通过敲低肾小管内皮细胞的MMP7表达后，激活性MMP2和MMP9表达明显下降，通过CO-IP试验发现MMP2和MMP9与TJP1 的结合也减少。在炎症反应中，敲低MM7后，SPP1和免疫细胞表面受体CD44结合明显减弱。由此，MMP7通过激活MMP2/9破坏细胞膜蛋白和连接蛋白，导致肾小管内皮细胞脱离，另一方面，MMP7可以剪切SPP1，提高与CD44的结合促进免疫细胞浸润促发炎症反应。在肾脏低温机械灌注的研究中发现，HMP相较于冷保存（CS）来说，能够降低MDA等氧化应激有害物质的产生，同时，发现经HMP后，肾脏磷酸化ALDH2的表达增高而线粒体自噬的标志物表达减少。进一步，在HMP灌注液中分别添加ALDH2的激动剂和抑制剂，结果发现，添加抑制剂后HMP的保护肾脏效果受到明显的负作用，而添加alda-1可增强HMP的保护效果。同时也发现，随着抑制剂的使用，线粒体自噬水平增高。由此得到，HMP通过激活ALDH2抑制氧化应激反应水平的同时降低线粒体自噬而保护供体肾脏。.本课题从肾脏IRI的机制研究到供体肾脏修复的研究，为肾移植提供可靠的理论依据，同时为HMP的临床应用提供了坚实的理论基础，有利于HMP灌注液的优化和改进。为肾移植受者术后恢复奠定基石。