内淋巴囊上皮细胞在内耳免疫调控作用中的分子机制研究

In previous studies, we have successfully cultured the epithelial cells of lymphatic sac, and approved its immunocompetence to present antigens. So far, there are no further reports on the immunocompetence of epithelial cells of lymphatic sac in the world. Our current study based on results in previous research is intended to discuss the modulation effect of immunity microenvironment towards the Treg cells, further explore the differentiation induction and modulation mechanism of immunity microenvironment of lymphatic sac with epithelial cells as the mainstay, and finally confirm the effect of epithelial cells of lymphatic sac possibly in immune response modulation. The study was designed to provide profound understanding of local immune modulation mechanism within inner ears, and worked for the prevention and treatment of autoimmune inner ear disease (AIED) with new theoretical basis and targets. The study is therefore extraordinary in both clinical significance and social values.

内淋巴囊上皮细胞除了参加内淋巴液的代谢循环外，还可能作为免疫器官在内耳免疫性疾病发生中发挥重要作用，迄今为止对其功能及其与免疫性内耳疾病的关系知之甚少。我们前期的研究在体外成功的培养了内淋巴囊上皮细胞并发现具有免疫活性能够呈递抗原。但其在内耳免疫中的调节机制有待于进一步探讨。据此提出内淋巴囊上皮细胞能够调控内耳的免疫活性并在免疫性内耳疾病中发挥作用。为了验证这一假说我们首先确认内淋巴囊免疫微环境的建立（已完成）。重点用流式细胞、PCR、Westen-blot验证内淋巴囊上皮细胞能够诱导增殖CD4+CD25+ Treg细胞；通过T细胞增殖抑制试验检测其抑制功能，ELISA技术检测其分泌调节细胞因子的功能；在上述试验的基础上将Treg细胞治疗免疫性内耳疾病的动物模型观察疗效，为免疫性内耳疾病的防治提供新的理论依据和可能的治疗靶点；从内淋巴囊上皮细胞这个新视点为揭示内耳的免疫调控机制奠定基础。

内淋巴囊上皮细胞除了参加内淋巴液的代谢循环外，还可能作为免疫器官在内耳免疫性疾病发生中发挥重要作用，迄今为止对其功能及其与免疫性内耳疾病的关系知之甚少。我们前期的研究在体外成功的培养了内淋巴囊上皮细胞并发现具有免疫活性能够呈递抗原。但其在内耳免疫中的调节机制有待于进一步探讨。据此提出内淋巴囊上皮细胞能够调控内耳的免疫活性并在免疫性内耳疾病中发挥作用。本项目实施四年中,我们按照计划书中实验方案执行：①在体外以不同浓度的GM-CSF、IL-4和IEAg刺激C57BL/6小鼠来源的内淋巴囊上皮细胞（HESC），发现以50ng/ml GM-CSF刺激HESC，其膜表面分子CD80，CD86，CTLA-4，ICAM-1上调明显，同时IL-2、IL-10和趋化因子CCR5、CCR7分泌增加，但IL-4和IEAg单独刺激，HESC无反应。②GM-CSF联合IEAg同时刺激内淋巴囊上皮细胞（HESC），其膜表面分子CD80，CD86，CTLA-4，ICAM-1上调明显，同时IL-2、IL-10和趋化因子CCR5、CCR7分泌增加，成功地建立内淋巴囊免疫微环境的体外研究模型；③在体外，我们将内淋巴囊上皮细胞（HESC）与CD4+CD25-细胞共培养，以50ng/ml GM-CSF刺激，检测到CD4+CD25-细胞的表面分子CD25、CD62L表达上调，Foxp3表达增高。阻断CCR5、CCR7后，发现诱导效果明显减弱，我们推测HESC可能通过CCR5/CCR7途径诱导CD4+CD25+ Foxp3+细胞的生成。④体外分离纯化诱导生成的CD4+CD25+ Foxp3+细胞，进行扩增， 经尾静脉输入 AIED 动物模型，发现动物模型体内外周循环中 CD4+CD25+Treg细胞数量上调；内淋巴囊内浸润细胞减少，听力好转。但 CD4+CD25+Treg 细胞输入的数量、时间、次数的不同对 AIED 的影响尚在进行中。我们的研究结果初步证实了小鼠内淋巴囊上皮细胞具有免疫调控功能，从内淋巴囊上皮细胞这个新视点为揭示内耳的免疫调控机制奠定基础。