从G0/G1期启动探讨小檗碱及黄连对缺血损伤脑神经原保护作用的位点

本课题创新性研究在于从缺血损伤启动神经细胞、使之由静止期（G0/G1）进入细胞周期所导致的神经原凋亡坏死这一病理变化出发，从细胞周期调控探讨小檗碱这种对缺血神经元保护作用的始动靶点及其可能的信号转导。从上游进行定位，力求从根本上研究小檗碱所表现出来的这种神经元保护作用的机制。同时在整体动物实验水平上与中药黄连进行对比，从一个侧面探讨黄连的这种功效及其与小檗碱的关系。以期有助于深入的对黄连及其该类清热解毒中药在脑功能调节临床应用的认识。

本项目按照任务书计划完成了相应的研究工作。进展顺利。取得了相应的结果。.小檗碱又称黄连素，属于苯甲基异喹啉类的生物碱，是常用的抑菌抗炎小分子药物，随着研究的不断深入，小檗碱的神经药理活性也成为研究的热点。脑中风的过程中伴随的神经元的大量死亡以及神经功能的减退，对终末分化的神经元的研究发现，神经元在发生凋亡的前期会重新进入细胞周期，而小檗碱又能使细胞停滞在G0/G1期，这就提示小檗碱对神经元的保护作用可能是通过阻止神经元进入细胞周期从而达到神经元的保护作用的。使神经元稳定和持续的维持在G0期是神经元行使正常功能所必须的。本研究为了探讨小檗碱在脑缺血损伤过程中对神经元细胞周期的影响以及对神经元的保护作用，建立了脑神经元损伤模型，包括原代神经元和PC12细胞的缺糖缺氧复灌模型和小鼠脑缺血再灌注模型。从整体动物、细胞和分子水平共同研究小檗碱对神经元细胞周期的影响，从而进一步的总结小檗碱的神经保护作用及其作用规律。.体内、体外实验结果表明，在脑中风模型中与G0/G1期细胞相关的基因P53、CyclinD1、Rb、E2F1以及与凋亡相关的基因caspase3都发生的变化，这些基因在mRNA和蛋白水平表达上发生改变的结果是诱导神经元进入细胞周期和细胞凋亡的发生。在细胞水平上将这些基因敲低或者敲除下游的凋亡信号将被阻断，提示在脑中风的过程中激活了神经元的细胞周期与凋亡。小檗碱可以显著的抑制脑中风损伤过程中神经元的细胞周期与凋亡。.小檗碱能够在蛋白和mRNA水平影响神经元的细胞周期，以及小檗碱的嗜碱基性，我们推测小檗碱可能影响了基因的转录以及mRNA的降解从而到达对基因的影响。建构基因的启动子和与mRNA降解相关元件的质粒，最终确定小檗碱的最终作用元件。.此外，我们还以PC12细胞作为研究对象，利用高效液相色谱（HPLC）、质谱（MS）等方法检测了小檗碱跨膜转运的研究。结果表明，小檗碱跨膜后在胞内没有检测到其他代谢产物，是以小檗碱的原型行使其功能。