雌激素受体靶向的细胞固相化萃取机制研究

细胞固相化萃取技术是研究中药复杂成分效应物质基础的高效手段，但对药物与其靶点结合过程知识的缺乏制约了该技术的应用与发展。本研究以雌激素受体为研究对象，针对受体-配体结合解离过程中的关键环节开展研究，使用雌激素受体高亲和力的配体17-beta 雌二醇、植物雌激素代表染料木黄酮及受体阻断剂ICI182780为工具，探讨与雌激素受体具有高亲和力配体的细胞固相化行为动力学特征，采用膜片钳技术及荧光素酶报告基因技术开展受体-配体结合效应动力学研究，通过结合-效应关联性的研究探讨雌激素受体-配体结合动力学特征，并在此基础上建立雌激素受体靶向的细胞固相化萃取方法。本研究为细胞固相萃取技术提供理论支撑，为从中药中与雌激素受体具有高亲和力的效应物质筛选提供有效手段，为采用其他靶标的细胞固相化萃取研究提供参考和借鉴。

细胞固相化萃取技术是研究中药复杂成分效应物质基础的高效手段，但对药物与其靶点结合过程知识的缺乏制约了该技术的应用与发展。本研究以雌激素受体为研究对象，针对受体-配体结合解离过程中的关键环节开展研究。.使用雌激素受体高亲和力的配体17-β雌二醇、植物雌激素代表染料木黄酮及受体阻断剂ICI182780为工具，探讨与雌激素受体具有高亲和力配体的细胞固相化行为动力学特征，结果表明雌激素受体与其配体可以迅速结合，随时间延长，不同细胞浓度受体配体结合率均增加，5×106个细胞结合60min后可以达到平衡。待受体-配体结合达到平衡后，用D-Hanks液进行洗脱，洗脱5次以后可达到平衡，进而加入pH 4.0的D-hanks作为变性剂进行解离，能够使3H-E2与配体解离，30min后可达到平衡。雌激素受体阴性细胞与3H-E2不能结合。在雌激素受体阳性细胞中，特异性阻断剂能够阻断3H-E2配体与受体的结合，证实了结合的特异性。雌激素受体阳性细胞破膜后，上清中配体放射量均明显上升，表明大量雌激素配体进入胞内。而阴性细胞无显著变化。.以染料木素作为高亲和力植物雌激素代表，观察其与雌激素受体的结合。结果表明，染料木素能够与MCF-7细胞结合，并有大量配体进入胞内。染料木素和大豆苷元对人乳腺癌细胞MCF-7能够呈浓度依赖性促进凋亡作用，该作用可能与钾通道有关。.选用当归芍药散，进行雌激素受体靶向的细胞固相化萃取的研究，探索应用该方法进行中药复杂成分中效应物质识别的研究。结果发现，在解离液和破膜液中有多个差异峰，并通过比对进行了鉴定等。经初步活性筛选后选择咖啡酸及藁本内酯两个代表性成分进行效应的进一步验证，结果表明咖啡酸低浓度时促进MCF-7细胞增殖，高浓度抑制，藁本内酯则浓度依赖性地抑制MCF-7细胞增殖。咖啡酸及藁本内酯使含雌激素反应组件-荧光素酶报告基因MCF-7细胞的萤光表达强度出现明显减弱，体现了被选样品的抗雌激素作用。藁本内酯和雌二醇与MCF-7细胞之间结合存在着竞争性，表明该结合过程可能与雌激素受体有关。.本研究通过对受体-配体结合解离动态过程的研究，为细胞固相萃取技术提供理论支撑；通过结合解离过程结合-效应关联性的研究探讨雌激素受体-配体结合动力学特征，并在此基础上建立了雌激素受体靶向的细胞固相化萃取方法。本研究为从中药中与雌激素受体具有高亲和力的效应物质筛选提供有效手段，为采