60Co-γ辐射诱变发酵丁醇新型芽孢杆菌Bacillus TSH1及其代谢特性的研究

生物丁醇是性能更接近石化汽油的可再生清洁能源，辐射诱变是获得高产突变菌株的重要方法。本项目从土壤、秸秆中筛选获得自主的野生产丁醇新型芽孢杆菌Bacillus TSH1，通过60Co-γ辐射诱变对菌株原生质体进行诱变处理，深入考察辐射剂量、时间、次数等对诱变原生质体的影响，以获得更为优良且稳定的高产丁醇突变菌株；优化诱变菌株发酵丁醇过程中pH、温度、时间等条件，进一步提高丁醇发酵水平；探讨辐射诱变原生质体对菌株代谢过程关键酶学特性的影响，研究辐射诱变菌株的代谢特性，设计合理的调控策略；从DNA分子水平考察原始菌株和突变菌株基因组学的差异，阐明辐射诱变原生质体的基因突变分子机理。通过本项目的研究，获得稳定优良的产丁醇新型芽孢杆菌Bacillus TSH1的突变菌株，并从酶学和分子生物学水平深入理解该菌株产丁醇的代谢特性，为发酵法生产新一代生物丁醇燃料提供新思路。

生物丁醇是性能更接近石化汽油的可再生清洁能源，辐射诱变是获得高产突变菌株的重要方法。项目通过60Co-γ辐射诱变筛选获得稳定优良的产丁醇新型突变株，考察了辐射诱变工艺，优化了发酵丁醇过程参数，探讨了代谢过程关键酶学和代谢特性，揭示了菌株基因组学的变化。为利用新型菌株发酵丁醇提供新思路。.1. 研究了60Co－γ辐射诱变工艺。当细胞培养15h添加1g/L甘氨酸和0.3U/L青霉素再培养2h，37℃下，2×104U/L溶菌酶作用8h脱壁，原生质体形成率和再生率分别达99.82%和10.12%。当辐射剂量率5 Gy/min、辐射剂量500 Gy时，原生质体致死率达99.3%。诱变变株具有良好的遗传稳定性。37℃下静置培养72h，总溶剂和丁醇产量均大幅提高。.2. 优化了菌株培养条件。培养基组成为葡萄糖54.7 g/L，酵母浸粉1 g/L，缓冲液8.9 ml/L，维生素液10ml/L，微量元素液10ml/L。当自然pH，摇瓶装液量55%，种子培养24h，接种量4%，37℃用带针孔胶塞密封静置培养，丁醇产量提高21%。补料发酵工艺表明在对数期以0.708g/(L•h)恒速流加40g/L葡萄糖，丁醇产量达 23.32 g/L，丁醇得率0.36g/g，丁醇生产强度0.2g/(L•h)，丁醇产量和生产强度分别提高了85.37%，33.33%。.3. 研究了丁醇代谢过程的关键酶：菌株有乙醇脱氢酶、丁醛脱氢酶，丁醇脱氢酶，乙酰乙酸脱羧酶以及辅酶A转移酶，可实现由乙醛到乙醇，丁酰辅酶A到丁醛再到丁醇，以及乙酰辅酶A到乙酰乙酸再到丙酮的转化，证明存在产溶剂代谢途径，这些酶在发酵开始时增加，达到最大值后降低。研究了丁醇的代谢流：产酸期流向生物量的代谢流高于产溶剂期，产溶剂期流向乙醇、丙酮、丁醇的代谢流高于产酸期，乙酸和丁酸代谢流从产酸期的生成转到产溶剂期的再吸收利用。氧浓度的变化对产酸期和产溶剂期的代谢流有明显的影响。.4. 研究了丁醇发酵代谢通路关键酶基因变化：关键酶基因在整个发酵过程均呈现高表达，而应激相关的基因表达则呈现波动性。研究了发酵代谢关键酶基因序列：产酸期诱变菌基因ctf、bdhA、bdhB和adhE的mRNA表达水平升高，其它基因mRNA表达水平降低；产溶剂期所有上述检测的基因在mRNA水平表达均升高。因此是关键酶基因的表达水平而非序列改变导致了诱变菌株与出发菌株的表型差异。