USP7多重变构调控机制和小分子抑制剂选择性识别机制的结构生物学研究

Ubiquitin specific protease 7 (USP7) plays a critical role in drug development targeting p53 and cancer immunotherapy. Based on the allosteric regulation mechanism of USP7, the development of highly selective allosteric inhibitors has been highly pursued in anticancer drug discovery, but it still encounters the following problems: 1) The multiple-layer allosteric regulation of USP7 is precise and complicated. 2) Limitation of high throughput screening method. 3) Lacking of high-resolution co-crystal structure of full-length USP7 with allosteric inhibitor complex. To solve these problems, we will first determine the crystal structures of USP7 under different activation states, and reveal the structural basis of USP7 multiple allosteric regulation mechanisms. Then, guided by the allosteric regulation mechanism of USP7, an accurate high-throughput screening method is established to identify new allosteric USP7 inhibitors combined with virtual screening and compound library screening. By solving the co-crystal structures of USP7 with small-molecule inhibitors, together with biochemistry, biophysics and cell-based assays, the selective recognition mechanism of inhibitors is preliminarily elucidated. This project will provide directions for further rational design and optimization of USP7 allosteric inhibitors with highly selective, and has important innovation and potential research value.

去泛素化蛋白酶7（USP7）在靶向p53的药物研发和肿瘤免疫治疗中发挥着关键作用。基于USP7的变构调控机制，开发高选择性的变构抑制剂一直是肿瘤靶向药物研发的热点，但仍面临以下问题：1）USP7变构调控机制精确而复杂。2）高通量筛选方案的局限性。3）高分辨率USP7全长-变构抑制剂复合体三维空间结构的缺乏。基于以上问题，本项目将首先解析不同激活状态下USP7全长及其复合体的晶体结构，揭示USP7多重变构调控机制的结构生物学基础。然后以USP7的变构调控机制为导向，优化建立精准的高通量筛选方案，结合计算机辅助的虚拟筛选和实体库筛选，寻找结构新颖的苗头化合物。通过解析USP7-小分子抑制剂的共晶结构，结合生物化学、生物物理学和细胞水平检测等手段，初步阐明小分子化合物的选择性识别机制。本项目将为进一步理性设计优化高选择性的USP7变构抑制剂提供思路和方向，具有重要的创新性和研究价值。

去泛素化特异性蛋白酶7（USP7）在靶向p53的药物研发和肿瘤免疫治疗中发挥着关键作用，是潜在的肿瘤靶向药物作用靶点。但基于USP7催化截断体开发报道的小分子抑制剂面临着潜在选择性毒性的挑战，限制了其临床应用，目前尚未有靶向USP7的药物进入临床研究阶段。因而基于USP7的变构调控机制开发高活性、高选择性且类药属性好的新型USP7小分子抑制剂具有较大的科学价值和临床应用前景。但USP7靶向药物研发仍面临以下问题：1）USP7变构调控机制精确而复杂，其结构基础尚不明确。2）目前报道高通量筛选方案的局限性如稳定性差、荧光干扰、耗时、成本低等限制了高选择性、高潜能USP7小分子抑制剂的开发。基于以上问题，本项目开展了以下研究内容：.1. 采用相对节省成本的大肠杆菌原核表达系统成功表达了人源USP7全长蛋白，并进行晶体筛选和优化。初步探索了USP7与辅助因子GMPS的结合模型。.2. 采用同源建模搭建不同激活状态下USP7全长结构模型，初步阐明USP7的多重变构调控机制。.3. 采用基于泛素前体UB52的酶切割实验检测USP7不同截短体的切割敏感性表明了USP7的不同结构元件在其变构调控过程中发挥功能的各异性，突出了USP7全长在药物发现中的必要性。.4. 基于AlphaFold和同源建模构建的USP7全长结构模型，预测发现了五个全新的潜在药物结合口袋。.5. 采用人源USP7全长蛋白模拟自然条件下的USP7激活状态，基于USP7全长和泛素前体UBA10蛋白成功建立了一套稳定、可靠的均相时间分辨荧光HTRF新型高通量筛选方法。通过开展化合物筛选，获得19个苗头化合物，并展开了肿瘤免疫调控机制的初步探索。.通过以上研究，初步阐明了USP7多重变构调控机制的结构基础。基于USP7的变构调控机制，采用USP7全长蛋白成功建立精准高通量筛选方法，多个结构骨架新型的苗头化合物为进一步结构优化提供了结构模板。