J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白免疫受体酪氨酸信号通路研究

Different from other subgroups of avian leukosis virus (ALV), ALV-J causes hematopoietic malignancy and immune suppression, and mainly induces myeloid leukosis and hemangioma. The unique Env of ALV-J has been hypothesized to be related with its unique pathogenesis, but its molecular mechanism has not been clarified. Our previous studies found ITIM, YxxM and ITAM-like immunoreceptor tyrosine-based signal pathway motifs associated with immune disease and leukemogenesis are presented in the Env of ALV-J. Can the ALV-J Env conduct immunoreceptor tyrosine-based signal pathway through these motifs? Can the ALV-J Env do the same thing as the Env of Jaagsiekte sheep retrovirus and mouse mammary tumor virus, both showing oncogenesis? In this study, we plan to study on the immunoreceptor tyrosine-based signal pathway conducted by ALV-J Env. The phosphorylation of Env, interaction between Env and phosphatase or kinase, transformed phenotype of Env, and the relationship between Env and ALV-J pathogenesis will be tested and clarified in vitro and in vivo through PCR site mutagenesis, ALV-J infectious cloning, virus rescuing, stable cell line, pathogenesis et al. The results from this program will reveal the novel function of ALV-J Env and its high identity sequence EAV-HP Env for conducting immunoreceptor tyrosine-based signal pathway, discover new molecular mechanism for ALV-J pathogenesis, and pave the way for anti-viral treatment and drug development.

与其它亚群禽白血病病毒（ALV）不同，ALV-J主要引起造血细胞恶性增生、免疫抑制，诱导髓细胞瘤，血管瘤等。ALV-J独特囊膜蛋白Env被认为与其独特致病性相关，然其分子机理尚不清楚。我们发现，在ALV-JEnv中存在ITIM，YxxM以及类ITAM等免疫疾病、白血病发生相关免疫受体酪氨酸信号基序。那么，这些基序是否有功能？ALV-JEnv会不会与绵羊肺腺瘤及小鼠乳腺瘤反转录病毒Env一样具有转化致瘤功能呢？本项目拟对ALV-JEnv免疫受体酪氨酸信号通路进行研究：通过定点突变、传染性克隆构建、病毒拯救、细胞系构建、致病性试验等，检测Env磷酸化，与磷酸酶、激酶作用，转化表型，与ALV-J 致病致瘤关系。本项目的顺利开展，将揭示ALV-JEnv及其同源序列EAV-HP Env具有传递免疫受体酪氨酸信号通路的新功能，ALV-J致病致瘤新机理，并为开发抗ALV-J新药开拓思路，提供理论依据。

J亚群禽白血病病毒（ALV-J）主要引起鸡的造血细胞恶性增生以及免疫抑制。ALV-J囊膜蛋白Env与鸡内源性序列EAV-HP Env的高度同源性被认为与其独特致病性可能相关，然其分子机理尚不清楚。本项目在发现ALV-J以及EAV-HP Env蛋白中存在ITIM，YxxM以及类ITAM等免疫疾病、白血病发生相关免疫受体酪氨酸信号基序的基础上，首先克隆了含有不同ITIM、YxxM以及类ITAM基序的ALV-J以及EAV-HP Env基因及其GP37基因，并拯救出表达不同Env基因的相应ALV-J病毒；构建与拯救了ALV-J病毒Env蛋白中ITIM，YxxM以及类ITAM基序中不同酪氨酸的变体病毒；构建了表达不同Env基因的DF-1细胞系。体内外试验首次发现：ALV-J Env蛋白中ITIM，YxxM以及类ITAM基序影响病毒复制，含有YxxM以及类ITAM基序的ALV-J病毒（4871毒株）复制能力最强，其次为含ITIM以及YxxM的ALV-J（J1)，仅含ITIM的ALV-J(EAV-HP)复制能力最弱；发现含YxxM以及类ITAM基序的ALV-J病毒Env蛋白可抑制其它病毒复制；ALV-J及其Env蛋白均能有效下调DF1以及HD11细胞中内源性SHP2的磷酸化；在鸡的感染性实验中进一步发现ALV-J感染也可下调鸡的肾脏以及脾脏中内源性SHP2的磷酸化水平；而ALV-J以及EAV-HP的Env蛋白gp37结构域被证明还能显著下调外源高表达的SHP2蛋白,变体试验进一步证明gp37这个功能主要依赖gp37的跨膜区；DF-1细胞中高表达外源性SHP2则可有效促进ALV-J病毒的复制，且发现SHP2的这一功能不依赖于SHP2的磷酸酶结构域及其活性；利用基于CRISPR-CAS9技术敲除SHP2的鸡肝细胞系进一步发现，内源性SHP2的缺失以及SHP2变构抑制剂均可抑制ALV-J的复制。以上这些研究发现明确了Env蛋白中ITIM，YxxM以及类ITAM基序对ALV-J病毒复制的影响作用；ALV-J及其Env蛋白与宿主细胞SHP2的关系作用的发现为进一步解析ALV-J独特致病性提供了线索，为开发抗ALV-J策略提供了靶点，SHP2抑制剂有望被开发为抗ALV-J药物。