清半夏“长于燥湿化痰”的“大分子”物质及作用机制研究

Pinelliae Rhizoma Praeparatum Cum Alumine (PA) specializes in “eliminating dampness and phlegm”, and is one of the most important drugs for treating damp-phlegm syndromes. Currently, the toxicological substances of PA is clear, however, active substances base and related mechanisms of “eliminating dampness and phlegm” in PA are still not clear. Our preliminary experiment indicated that the “macromolecules” in PA can significant down-regulate the MUC5AC which is a key target for release of phlegm. Therefore, we proposed that “macromolecules” (polysaccharides, proteins, etc.) in PA is one of the main substances base for “eliminating dampness and phlegm”, and the mechanism is related to regulating effects on MUC5AC and AQP5. Thus, we plan to isolate and identify the active macromolecules in PA guided by activity of “eliminating dampness and phlegm”, and systemically evaluate the effects and possible mechanisms of active “macromolecules” by using animal model and modern molecular biological techniques. In addition, the relationships between agents in “macromolecules” (polysaccharides, proteins, and others) will be studied, and the effects of alum on PA will be also investigated in our future study. Our project will be beneficial for clarification the substances base and pharmacological mechanisms of PA. In addition, our project would supply a new horizon for investigating of Pinellia ternate and its prepared products, and afford the direction for studying the substance base of prepared products of traditional Chinese medicine and related processing theory.

清半夏功能“长于燥湿化痰”，为中医治疗“湿痰”的要药。目前半夏及炮制品毒性的物质基础及作用机理行业内已有定论，但其发挥功能的活性物质基础与机制尚不明确。通过前期研究发现，半夏“大分子”物质可明显抑制湿痰证模型大鼠痰液分泌量等，故本项目以清半夏“燥湿化痰”的功能为切入点，提出工作假说：清半夏“大分子”（多糖、蛋白）物质也是“燥湿化痰”的物质基础，其机制与调节MUC5AC和AQP5蛋白的表达相关。在“大分子”物质不同分子量部分的分离与活性筛选的基础上，采用提取分离纯化、精制和结构鉴定等新技术，研究清半夏功能相关的“大分子”物质，明确其“燥湿化痰”的物质基础；同时结合分子生物学技术，从基因和蛋白层面，研究清半夏“大分子”物质对MUC5AC和AQP5蛋白表达的影响，阐明“长于燥湿化痰”作用机制。本项目旨在为半夏及其炮制品“燥湿化痰”的物质基础及作用机制研究提供新思路，同时可为中药炮制科学内涵的研究

本项目以清半夏“燥湿化痰”的功能为切入点，立足于提出的工作假说，主要进行了清半夏“长于燥湿化痰”的大分子物质多糖的提取、分离与结构鉴定，清半夏“长于燥湿化痰”作用相关的“大分子”物质活性评价及作用机制研究，清半夏炮制前后“燥湿化痰”相关成分的变化分析，清半夏“长于燥湿化痰”的“谱效”关系及白矾的相关性研究和半夏蒸制新工艺的研究。.通过膜分离技术成功分离了清半夏大、小分子成分，并通过实验表明大、小分子类成分对清半夏“长于燥湿化痰”均起到重要作用。通过响应面法优化了清半夏多糖的提取工艺，进一步通过DEAE-52、Sephadex G-50和Sephacryl S-300分离纯化共获得2个均一多糖成分（中性多糖TPN-II和酸性多糖TPA-II）。分别以红外光谱（IR）、分子量分布和单糖组成分析表征了均一多糖的结构。研究发现，多糖可能通过抑制过敏性哮喘大鼠肺、结肠中HMGB1/RAGE信号通路激活，调节肺、结肠AQP5，MUC5AC表达，升高呼吸道、肠道中优势菌丰度，在肺、结肠多方向地发挥缓解过敏性哮喘作用。分离的多糖TPN-II和TPA-II能降低NCI-H292细胞中IL-4水平，升高IFN-γ水平，并对MUC5AC蛋白表达具有下调作用，表明其是清半夏“长于燥湿化痰”的大分子物质基础。.通过分析发现，炮制使清半夏小分子种类和含量发生变化，多糖的含量和结构在炮制后也发生了明显改变。“谱效”关系研究结果表明，不同批次清半夏的白矾含量与其降低细胞MUC5AC蛋白表达的作用之间具有一定的相关性；通过灰色关联度和多元线性回归分析建立了20批清半夏HPLC指纹图谱与MUC5AC蛋白降低率之间的“谱效”关系；初步确定了清半夏中酪氨酸，尿嘧啶，鸟苷，5-羟甲基糠醛，未知成分UN-1和UN-11与降低MUC5AC蛋白表达之间具有显著相关性，可能为清半夏“长于燥湿化痰”的小分子物质基础。.最后通过对半夏炮制前后毒效和化学成分变化规律的研究，证实了半夏经高压蒸制可实现减毒、存/增效的目的，体现了其合理性，并初步确立最佳半夏蒸制工艺，为高压蒸制半夏的新工艺的建立提供了可靠的依据，同时也为丰富与发展半夏炮制品的种类提供了新思路。