NKT细胞经由CD1d和TLR调控活化在雷公藤甲素肝毒性中的作用机制研究

Tripterygium wilfordii preparations have excellent efficacy in treatment of autoimmune diseases. However, their hepatotoxicity greatly limits the clinical application and the mechanisms of hepatotoxicity have not been clarified. Triptolide (TP) is the main active ingredient and toxic component of Tripterygium wilfordii. Results of this study showed that NKT cells were highly activated in mouse model of TP-induced hepatotoxicity. NKT cells link the innate and adaptive immunity and plays an important role in drug-induced Liver injury. Therefore, we hypothesized that NKT cells were involved in TP-induced liver injury through direct activation of CD1d and indirect activation of Toll-like receptor (TLR). In order to investigate the novel target of TP-induced liver injury, we used Crispr/Cas9, CD1d-deficient mice and TLR knockout mice. By using NKT cell specific agonist α-GalCer, depletion and adoptive transfer of NKT cells, we explore the innovative immune treatment plan targeting NKT cells. Our studies would provide experimental basis for the clinical prevention and therapy of Tripterygium wilfordii preparation-induced hepatotoxicity.

雷公藤制剂在自身免疫性疾病的治疗中具有出色疗效，但其肝毒性极大地限制了其临床应用，且毒性作用机制尚未阐明。雷公藤甲素（TP）为雷公藤的主要活性成分和毒性成分，本项目前期研究发现小鼠TP肝毒性模型中，NKT细胞高度活化。NKT细胞连接天然免疫和适应性免疫，在药源性肝损伤中发挥着重要的作用。由此提出假设：NKT细胞通过CD1d的直接活化和Toll样受体（TLR）的间接活化参与了TP诱导肝损伤。本项目应用Crispr/Cas9、CD1d缺陷小鼠和TLR敲除小鼠等寻找TP肝损伤的新靶点，通过NKT细胞特异性活化剂α-GalCer、清除及过继转输NKT细胞等影响TP肝毒性，探索TP肝损伤的免疫治疗新手段。最终为雷公藤制剂肝毒性的临床防治提供实验依据。

雷公藤制剂在自身免疫性疾病的治疗中具有出色疗效，但其肝毒性是困扰其临床应用的关键，且毒性机制尚未阐明。雷公藤甲素（TP）为雷公藤的主要活性成分和毒性成分，由于其诱发的多器官毒性，特别是肝毒性严重制约了TP的成药和临床应用。本课题在体内外模型中均发现TP诱导NKT细胞活化。在TP诱导肝损伤的体内模型中，DAMP-TLR2-MyD88信号通路上调，可能使NKT细胞迅速活化，分泌的Th1/Th2细胞因子失衡，随后肝脏的中性粒细胞和巨噬细胞蓄积增加；采用抗-NK1.1抗体预先清除大部分NKT细胞后，TP肝毒性明显减轻，调节NKT细胞分泌的Th1/Th2细胞因子，显著减少肝脏蓄积的中性粒细胞和巨噬细胞。.肝损伤可分为肝细胞损伤、胆汁淤积和混合型。在TP诱导肝损伤的体内模型中，除了肝细胞损伤，还发现了胆汁淤积性肝损伤。胆汁淤积相关的转录因子Egr-1和粘附分子ICAM-1上调，胆汁酸转运体OATP1B2、BSEP，胆汁酸合成酶CYP7A1、CYP8B1和CYP27A1和胆汁酸代谢酶CYP2B10下调。采用1型NKT（iNKT）细胞敲除小鼠（Jα18-/-小鼠），TP肝毒性显著减轻，可能是由于Egr-1和ICAM-1下调，OATP1B2和CYP2B10上调。同时，Jα18-/-小鼠给以TP后，NK细胞和2型NKT细胞比例增加，但NK细胞分泌的Th1/Th2细胞因子无显著性变化。给Jα18-/-小鼠过继转输Jα18-/-小鼠或野生型（WT）小鼠的胸腺细胞后再给以TP，相比于过继转输Jα18-/-小鼠的胸腺细胞，Jα18-/-小鼠过继转输WT小鼠胸腺细胞后，会显著增加肝脏iNKT细胞，但NK细胞和2型NKT细胞比例不变，提示iNKT细胞对2型NKT细胞具有一定的抑制作用，Jα18-/-小鼠失去了iNKT细胞对2型NKT细胞的抑制作用，2型NKT细胞比例升高，可能是TP肝损伤减轻的原因之一。.综上，TP诱导iNKT细胞的活化，iNKT细胞分泌的Th1/Th2细胞因子失衡，随后肝脏中性粒细胞和巨噬细胞的蓄积增加；清除iNKT细胞可能通过中性粒细胞和巨噬细胞的减少，2型NKT细胞的增加，Egr-1和ICAM-1的下调，OATP1B2和CYP2B10的上调来减轻TP诱导的肝损伤，提示上述靶点是TP诱导肝损伤的潜在毒性靶点。本研究结果为雷公藤制剂肝毒性的机制阐明和临床防治提供了实验依据。