酿酒酵母中新型rDNA阵列的设计合成与转录分析

rDNA is the coding sequence of ribosomal RNAs, which is essential for protein biosynthesis. rDNA exists in most eukaryotic genomes as tens to thousands of tandem repeats and is highly dynamic, which makes studies on its function difficult. In the synthetic yeast genome project (Sc2.0), we not only successfully synthesized a megabase chromosome XII, but also deleted the rDNA region on synthetic chromosome XII completely, regenerated it at three different chromosomal loci and swapped the S. cerevisiae ITS region to the corresponding region of S. bayanus. Using the latest synthetic genomics principles and techniques we learned from Sc2.0, we proposed to synthesize a new type of rDNA array in this project. A unique tag will be designed for each rDNA unit, making them distinguishable. These chimeric rDNA units will be assembled into arrays with different number of copies in different strains to replace the wild-type. Further transcriptional analysis will provide important evidences on how the transcriptional states among rDNA copies within the repetitive array is dynamically regulated. This will be the first fully synthetic construction of highly repetitive genomic sequences, which will enable scientists to track single rDNA units and study its transcriptional regulation in the context of chromosome. This study could provide technically and theoretically innovations for future study on synthetic genomics.

作为核糖体RNA的编码序列，rDNA对蛋白质合成必不可少。真核生物的rDNA区通常由几十到上万拷贝的串联重复单元组成，且拷贝数高度动态变化。这一特性是目前rDNA研究领域的主要障碍。作为酿酒酵母基因组合成计划的成员，本课题组完成了迄今为止最长的第XII号染色体的设计合成，实现了对该染色体上的rDNA区的完全敲除和再生。在此基础上，本项目拟利用最新的合成基因组学技术，设计并构建带有特定标记的rDNA转录单元，进而组装获得功能正常、数目稳定、单元各异的新型阵列，克服野生型rDNA高度重复所带来的研究困境。通过对该阵列的转录分析，为回答“细胞如何选择rDNA区内特定数目与分布的单元进行转录以满足正常生长需求”这一关键科学问题提供重要的实验证据。本项目是对高度重复序列开展从头合成与功能解析的重要尝试，将为后续复杂基因组的合成提供技术保障，具有重大的理论和实践意义。

核糖体RNA(rRNA)是核糖体进行蛋白翻译所需的关键组成部分。在野生型酵母中，rDNA区位于第XII号染色体右臂，由大约 150 拷贝的 rRNA 转录单元所组成。在前期酿酒酵母基因组合成计划中，我们实现了对rDNA区的完全敲除和再生。在此基础上，我们对rDNA展开了系列的后续研究：1）根据系列原则，以“SILVA”数据库为基础，分析、设计并验证获得了总共20个可用于后续功能分析的核糖体标签（rTAG）序列，保证了对合成 rDNA 转录单元的特异性标记；2）设计并合成构建了用于rTAG功能验证所需的功能验证质粒、整合接收载体和整合质粒，实现对rDNA转录单元功能的快速测定；3）建立了含有rTAG的rDNA转录单元的功能测试流程，获得了19个有功能的rTAG，表明我们的设计原则具有很好的科学性；4）构建获得了用于构建syn-rDNA阵列的起始菌株JHY173，为后续rDNA相关研究奠定了菌株基础；5）通过对整合了3个或者4个rDNA转录单元的菌株的Southern blot分析、生长分析、倍性分析和纳米孔测序分析，我们发现虽然敲除了rDNA扩增所需的FOB1基因，超过两个rDNA转录单元的串联仍然非常不稳定，极易发生扩增、删除和移位等结构变异，表明仍然还有未知的机制；6）为此，我们希望能够实现一步组装足够多的rDNA转录单元，从而避免rDNA转录单元不足所导致的强制扩增。因此，我们以第 XII 号染色体左臂的必需基因为前期测试载体，开发了多片段人工序列的一步组装方法，后续将可以用于多rDNA转录单元阵列的一步组装。本项目的系列研究是对高度重复序列开展从头合成与功能解析的初次尝试，为后续rDNA的进一步研究和复杂基因组的从头合成提供了技术保障。