金藻昆布糖合成的氮丰度转换调控及其作用机制研究

Chrysolaminarin are a group of glucan accumulating in diatoms, which shows potentials in treating diseases like cancer, infection, and inflammation. Nitrogen abundance has an obvious influence on chrysolaminarin synthesis, yet the process and mechanism is not clear. Nitrogen abundance conversion regulation and its action mechanism in chrysolaminarin synthesis in Odontella aurita and Phaeodactylum tricornutum would be studied by means of multiscale research strategy. At macroscopic scale, impact of nitrogen abundance on diatom growth as well as the content and productivity of chrysolaminarin would be studied. Hence, the regulation mode of nitrogen abundance conversion in chrysolaminarin synthesis would be clarified. At mesoscopic scale, chlorophyll fluorescence parameters and biomacromolecules surface functional group changes would be respectively determined by XE-PAM and FTIR. Cellular photosynthesis physiology and carbon partitioning change rule would be illustrated, and the cellular mechanism of chrysolaminarin synthesis under nitrogen abundance regulation would be elucidated. At microscopic scale, activity of the key enzyme in chrysolaminarin synthesis (UGPase) would be represented by a microplate reader, and the gene expression of UGP would be obtained by use of QRT-PCR. The cellular mechanism of nitrogen abundance regulation in chrysolaminarin synthesis would be elucidated combining homologous analysis of UGP cloning. Theoretical basis for the development of chrysolaminarin from diatoms and the adoption of nitrogen abundance regulation in chrysolaminarin synthesis would be provided with the research results.

金藻昆布糖是硅藻细胞合成的一类葡萄糖多聚物，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等生物活性功能。氮丰度显著影响金藻昆布糖的合成，但其过程和机制尙不清楚。本项目拟采用多尺度研究策略，对金色奥杜藻和三角褐指藻中金藻昆布糖合成的氮丰度调控模式及作用机制进行对比研究。宏观尺度下，对比不同氮丰度下两株硅藻生长、金藻昆布糖含量及产率的变化，明确氮丰度转换对金藻昆布糖合成的调控模式；介观尺度下，通过XE-PAM和FTIR光谱表征细胞叶绿素荧光参数和生物大分子表面官能团的变化，探索氮丰度转换下细胞光合生理及碳流分配规律，揭示氮丰度调控金藻昆布糖合成的细胞机制；微观尺度下，通过酶标仪和QRT-PCR同步表征金藻昆布糖合成中的关键酶——UGPase酶活性及基因表达变化，结合T载体克隆的同源性分析，揭示氮丰度调控金藻昆布糖合成的分子机制。研究结果为开发利用硅藻金藻昆布糖新资源，采取氮丰度调控金藻昆布糖合成积累提供理论指导。

金藻昆布糖是硅藻细胞合成的一类葡萄糖多聚物，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等生物活性功能。本项目以氮丰度转换调控为手段，从生理生化、光合生理和基因转录等方面对金色奥杜藻（Odontella aurita）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中金藻昆布糖的代谢过程和调控机理进行了研究。氮丰度对两株硅藻生长具有显著影响，氮缺乏条件下生物量和叶绿素含量显著低于氮充足条件，氮恢复后生长指标都能快速恢复。氮缺乏条件下金色奥杜藻的金藻昆布糖含量大幅提升，最高可达干重的68.55%；三角褐指藻的金藻昆布糖含量小幅上升，最高达干重的29.4%；当氮恢复后，两株硅藻的金藻昆布糖含量都迅速下降。不同氮丰度下两株硅藻的叶绿素荧光参数时相变化表明，藻细胞光系统Ⅱ（PS Ⅱ）活性和氮丰度直接相关。当培养液中氮素不断消耗时，叶绿素荧光参数如最大光能转换效率（Fv/Fm）、PS Ⅱ实际量子产量（yield）和电子传递速率（ETR）呈下降趋势，PS Ⅱ活性逐渐降低。FTIR光谱分析表明氮缺乏时，细胞内蛋白质合成量下降，储能物质含量逐渐升高，其中金色奥杜藻以碳水化合物为主，三角褐指藻则同时积累脂类和碳水化合物；当氮恢复后，储能物质含量下降，细胞将其分解用于生长和物质代谢。不同氮丰度下尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）活性变化与金藻昆布糖含量的变化过程基本一致，氮缺乏时金色奥杜藻UGPase活性比接种时提高了2.83倍，达到6.69 µmol min-1 mg-1，大大促进了金藻昆布糖的合成。从两株硅藻的转录组和代谢通路差异分析来看，氮丰度转换下金色奥杜藻与三角褐指藻在碳水化合物代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢以及部分次级产物代谢等通路出现了表达上的显著差异。金色奥杜藻对氮缺乏较为敏感，在氮缺乏下有14条代谢通路受到影响，而三角褐指藻仅有7条。金色奥杜藻除了碳水化合物代谢、脂代谢、能量代谢等通路受到影响外，类胡萝卜素合成、辅酶因子和维生素代谢以及部分次级代谢产物的生物合成也受到影响，而三角褐指藻中却没有出现显著差异。在碳水化合物代谢中，除共同受影响的通路外，金色奥杜藻主要受影响的为丙酮酸代谢，而三角褐指藻主要为乙醛酸和二羧酸代谢、丙酸代谢、磷酸戊糖途径和糖酵解/糖原异生通路等。