用于肝癌早期检测的外泌体可视化集成流式细胞仪研究

As a malignant tumor with a high mortality rate, liver cancer is a serious threat to human health. Current technologies have certain limitations for liver cancer early detection, thus it is of great significance to reduce the mortality of liver cancer patients by developing methods for liver cancer early detection. Recent research shows that exosomes, which are important components of the tumor microenvironment, play an important role in the development of liver cancer and become a promising new tumor marker. This applicant has years of experiences in label-free light scattering technology and microfluidics, and has developed the label-free static cytometry and light-sheet based microfluidic cytometry recently. Based on the applicant's research background, this project will integrate two-dimensional light scattering imaging technology, fluorescence imaging technology and light sheet illumination technology for the imaging of light scattering and fluorescence from exosomes and their tumor markers, aiming to provide a detection method for the imaging of flowing exosomes. Secondly, this project will observe the exosomes from hepatoma cells and normal liver cells (cell lines) to explore the characteristic differences between them, and try to establish a correlation between exosome characteristics and hepatocyte status. Finally, the characteristics of exosomes during the development of liver cancer in mouse models will be studied to explore the possibility for the early diagnosis of liver cancer by the detection of exosomes. This project may provide research foundations for the imaging of flowing exosomes and for liver cancer early detection.

肝癌作为一种死亡率很高的恶性肿瘤严重威胁着人类健康。当前技术在肝癌早期诊断方面尚具有一定的局限性，研发肝癌早期诊断方法在降低肝癌死亡率方面具有重要意义。近期研究表明，作为肿瘤微环境重要成分的外泌体在肿瘤演进过程中具有重要作用，是一种有前景的新兴肿瘤标记物。申请人具有多年的免标记光散射技术、微流控技术研究基础，近期研发了免标记静态细胞术以及光片照明微流控细胞术。基于申请人已有研究基础，本项目拟集成二维光散射成像技术、荧光成像技术和光片照明技术实现外泌体及其携带标记物的散射与荧光联合成像检测，提供一种外泌体可视化流式检测新途径。项目拟通过分别检测肝癌细胞和正常肝细胞（细胞系）来源外泌体之间的特性差异，尝试建立外泌体特征与肝细胞状态的关联性。然后通过小鼠肝癌建模，研究肝癌演进过程中的外泌体特性，探索肝癌早期诊断外泌体检测技术。项目将为外泌体流式可视化技术以及肝癌早期检测技术提供研究基础。

肝癌是全球范围内常见的消化系统恶性肿瘤，中国肝癌死亡人数约占全球肝癌死亡人数的50%，肝癌已成为威胁我国人民健康以及生命安全的最严重疾病之一。研发肝癌早期诊断技术有望降低肝癌致死率。外泌体（exosome）是一种纳米尺寸的膜囊泡，近期研究发现癌细胞与正常细胞外泌体或胞外囊泡之间存在一定的数量和成分差异性，外泌体或胞外囊泡在作为肝脏病理诊断的新兴生物标志物方面具有巨大的潜力和较高的研究价值。流式细胞仪是一种可以测量流体中细胞或颗粒性质的高通量仪器，开展用于肝癌早期检测的外泌体可视化流式细胞仪研究具有重要意义。项目通过二维光散射、光片照明及人工智能等技术集成，实现了基于人工智能技术的亚微米颗粒和细胞的可视化识别，以及基于深度学习的外泌体尺寸纳米颗粒（低至41 nm）可视化识别。项目研发了深度学习小细胞外囊泡分析技术（DeepEVAnalyzer），发现了肝癌细胞（Hep G2细胞系），药物处理后的Hep G2肝癌细胞，与正常肝细胞（CCC-HEL-1细胞系）来源的小细胞外囊泡（主要分布区域：50-150 nm）尺寸分布差异性，实现了基于外泌体可视化的上述三类肝癌细胞的分类识别。项目进一步集成二维光散射技术、荧光光谱技术等，实现了纳米颗粒及外泌体可视化集成流式细胞仪技术，光谱识别精度约1 nm/pixel左右，并开展了基于小动物模型的正常肝细胞与肝癌来源外泌体(尺寸主要分布区域：50-150 nm）的分类识别探索。项目通过开展肝癌来源外泌体的流式可视化等学科交叉研究，获得了不同肝细胞来源外泌体或胞外囊泡大数据，有助于进一步促进外泌体与肝癌演化进程相关性的研究。项目所实现的深度学习小细胞外囊泡分析仪技术以及外泌体可视化流式细胞仪技术，有望促进外泌体或胞外囊泡作为肿瘤标记物的研究，在癌症等重大疾病诊疗领域具有较好的科研意义和应用价值。