基于高特异性基因重组乙酰胆碱酯酶抗体的压电免疫传感器精确快速鉴别周围神经感觉束与运动束

In peripheral nerve injury repairing, how to quickly and accurately distinguish the motor and sensory bundles of neural stems has long plagued the scholars. Preliminary work in this study, had achieved the quick (within 6 minutes), accurate (accuracy rate of 90% or more) detection of acetylcholinesterase (AChE) content in spinal nerve directly; then distinguished ventral root (motor bundle) and dorsal root (sensory bundle) using piezoelectric immunosensor method. However, abundant capillaries surrounded the peripheral nerve epineurium, endometrium and perineurium. Erythrocyte membrane also contains AChE. The blood supply of spinal nerve roots were weakly, and the detection was not significantly affected. Therefore, blood contamination can interfere with the fast and accurate identification of nerve bundles. A novel high specificity recombinant AChE antibodies which only specific binding within the AChE of peripheral nerve bundles but do not cross-react with the AChE of erythrocyte membrane was needed. The antibodies can exclude the interference of blood contamination during detection. And then this piezoelectric immunosensor method can solve the problem that nerve bundles cannot be accurate and fast identified during surgical repair of peripheral nerve injury. It also can improve nerve functional recovery rate after the surgical repair of peripheral nerve injury.

周围神经损伤后的修复中，如何快速准确地分辨出神经干内运动束与感觉束长期困扰国内外学者。本研究的前期工作，初步实现了用压电免疫传感器法直接检测脊神经根乙酰胆碱酯酶（AChE）含量来快速（6分钟内）、准确（准确率90%以上）分辨脊神经前根（运动束）与后根（感觉束）。然而周围神经外膜，内膜及神经束膜之间分布有丰富的毛细血管网，故周围神经内神经束在取材检测过程中不可避免受到大量红细胞的沾染，而血红细胞膜亦存在AChE；脊神经根无明显外膜，且血供微弱，检测不受明显影响。故血液沾染可能干扰周围神经束的快速精确鉴别。本课题拟在以往工作基础上研发一种新型的高特异性基因重组AChE抗体，其仅能特异性结合周围神经束内的AChE，不与血红细胞膜上的AChE发生交叉反应。该抗体可排除检测过程中血液沾染的干扰。进而解决周围神经损伤修复术中不能精确快速确鉴别神经束性质的这一难题，提高周围神经损伤修复术后的功能恢复率。

项目背景：膀胱功能障碍，是脊髓损伤病人生活质量的受损和病人死亡的主要原因之一。近年来逐渐开展起来的“神经移位手术”，即利用残存的运动神经，重建膀胱的反射弧，使病人部分实现自主排尿功能。.主要研究内容：我们课题组先前的研究表明，利用免疫压电传感器能够实时鉴别溶液中微克级别的乙酰胆碱酯酶的含量，而脊髓前根乙酰胆碱酯酶的含量远远高于脊髓后根。本研究应用我们先前建立起来的免疫压电传感器技术，检测了捐献遗体的脊髓前后根乙酰胆碱酯酶的含量，探讨了此技术临床应用于鉴别脊髓前后根的可能性。.重要结果和关键数据：我们首先用QCM检测了不同浓度的乙酰胆碱酯酶溶液，发现当含有乙酰胆碱酯酶的溶液负荷到芯片上，6分钟之内，QCM的振荡频率即出现显著变化，且QCM频率的变化在0.5 μg/ml t到10μg /ml浓度范围内呈线性关系。我们分别检测了从胸11到骶3的脊髓前后根的QCM的变化频率和根据回归方程计算出来的脊髓前后根浸出液中乙酰胆碱酯酶的浓度，发现后根普遍较前根粗大，两者所致频率变化差别不大。为进一步证实QCM的结果，我们对各个节段的脊髓前后根做了ACHE和NF200的免疫组化染色，并利用图像分析技术计算出了各个节段脊髓前后根的乙酰胆碱酯酶阳性纤维束占到整个神经纤维的百分比，发现前后根乙酰胆碱酯酶计数的绝对数量差别不大，但是在各自神经根内所占百分比有显著差别。.科学意义：本研究首次利用QCM检测了新鲜尸体脊髓前根和后根的乙酰胆碱酯酶的含量。QCM的结果显示，在QCM频率的变化在乙酰胆碱浓度为0.5 μg/ml 到10μg /ml的范围内呈线性关系。在QCM的检测范围内，也就证实了利用QCM检测前后根断端浸出液中乙酰胆碱酯酶含量的可能性。同时，免疫组化的结果显示，不同节段的脊髓后根中乙酰胆碱酯酶阳性纤维的百分比也不尽相同，结果与QCM的结果完全一致。综上所述，本实验建立起一种快速准确鉴别人体脊髓前后根，判断脊神经前根运动性能的方法，有望应用于硬膜外神经移位手术，治疗脊髓损伤后的膀胱功能障碍。