胞内钙库钙通道在癫痫发病中的作用研究

神经元钙稳态失衡发生钙振荡被认为与癫痫发生密切相关。神经元钙稳态受胞膜钙通道、胞内钙库钙通道及钙结合蛋白等调控。国内外关于癫痫状态下钙通道变化的研究大多集中在胞膜钙通道的变化，关于胞内钙库钙调控通道的研究则罕见。鉴于神经元胞内钙库对自身细胞内钙具有重要的调控作用，而后者直接影响到神经元的兴奋性，本研究拟在小鼠癫痫模型上，通过免疫组织化学染色，免疫荧光结合激光共聚焦细胞断层扫描、Western Blot、实时定量PCR及受体拮抗剂和激动剂干预结合动物行为学观察等方法，观察癫痫状态下神经元钙库钙通道兰尼碱受体（Ryanodine receptor， RyR）和三磷酸肌醇受体(IP3R)变化情况（包括分布变化及蛋白和基因水平的表达变化），目的在于阐明胞内钙库钙通道变化与癫痫发生的相互关系。该研究将对癫痫钙稳态失衡理论进一步完善，可望为针对钙稳态失衡的癫痫防治及新药开发提供理论基础，具有研究价值。

结题报告摘要.《钙库钙通道在癫痫发病中的作用研究》项目具体实验内容及结果总结如下。.1. 实验采用pilocarpine腹腔注射诱导建立癫痫小鼠模型，行为学评价方面，模型在诱导发作阶段对潜伏期、发作行为、发作持续时间及成活率做了详尽的记录评估；慢性期内对小鼠癫痫自主发作开始时间、发作表现及持续时间记录评估。形态学方面，诱导发作期和急性期对脑内应激蛋白c-fos的表达变化、脑内神经元丢失和胶质化情况分别进行详尽的对比评估。行为学和形态学评估证实癫痫模型构建是成功的，完全能够用于癫痫发病机制探索研究。.2. 免疫组化染色和免疫电镜证实三磷酸肌醇受体（IP3R）和兰尼碱受体（RyR）在正常小鼠脑内存在广泛分布，尤其是在颞叶癫痫最易受累及的脑区海马和内嗅皮层及梨状皮层存在丰富的分布，揭示了该两型受体在癫痫发生中可能的重要角色。癫痫模型小鼠受累脑区IP3R和RyR分布较对照组发生明显的变化，揭示颞叶癫痫发生与胞内钙库相关。.3. 免疫荧光标记一方面证实IP3R和RyR在海马抑制性中间神经元上存在分布，且双标记神经元比例在癫痫模型上发生明显变化，揭示胞内钙库对海马内抑制性中间神经元功能具有调节作用。另一方面，胶质化的海马胶质细胞异常表达IP3R和RyR，揭示癫痫形成过程中胶质细胞异常的钙震荡可能发挥作用。.4. 蛋白水平Western Blot实验证实海马内各型IP3R及磷酸化IP3R从诱发1小时开始直至诱发后2个月存在持久的变化；进一步揭示癫痫发生和胞内钙库IP3R调控通道存在某种关系。.5. 实时定量PCR实验发现，癫痫状态下海马IP3R及RyR在基因水平亦发生变化，揭示癫痫状态下出现胞内钙库基因水平调控异常。.6. 钙库通道激动剂及拮抗剂干预发现，IP3R和RyR激活后癫痫发生的潜伏期明显缩短而发作持续时间则明显延长，相反，拮抗剂虽然不能完全阻止癫痫的发生，但其诱发潜伏期明显延长，发作持续时间明显缩短。揭示颞叶癫痫的发生与胞内钙库异常存在密切关系。.课题研究结论：癫痫的发生与神经元及反应性胶质细胞钙振荡存在密切关系，神经元和异常的星形胶质细胞钙振荡不仅与胞膜钙通道相关，胞内钙库通道（IP3R和RyR）成分在钙振荡中亦发挥着重要作用！在癫痫防治上，不仅要考虑胞膜钙通道的异常化，同时要考虑胞内钙库通道的异常变化，针对癫痫防治新药的开发，需要综合考虑钙振荡形成的多元性和复杂性。