矮牵牛E3泛素连接酶PhXB3调节花瓣衰老的分子机理研究

Protein ubiquitination is an important post-translational modification (PTM) that regulates almost every aspect of cellular function and many cell signaling pathways in Plant. PhXB3, a RING domain ankyrin repeat protein, is an E3 ubiquitin ligase and is involved in flower senescence and cell death. However, the molecular mechanism is not known. The targeted proteins of ubiquitination modification by PhXB3 and their function will be identified. ①The proteins interacting with PhXB3 will be screened by Y2H assays. ② In the plants of PhXB3 silencing or overexpression, the ubiquitinated specific substrate proteins of PhXB3 will be identified by proteome analysis and global analysis of ubiquitination. ③The ubiquitination modification of the targeted substrate proteins of PhXB3 will be confirmed by BiFC and Co-IP. ④The ORF sequence of gene coding substrate proteins will be isolated by RACE and the function of the substrate proteins during flower senescence will be identified by VIGS and transformation. The molecular strains of the PhXB3 involved in flower senescence will be determined. The results is important to further reveal the molecular mechanism of flower senescence and provide novel pathways to improve the quality of ornamental plant.

蛋白质泛素化修饰在植物生长发育过程中发挥重要作用。矮牵牛E3泛素连接酶PhXB3可调节花衰老和叶片细胞死亡，但其分子机理未知。本项目拟鉴定矮牵牛PhXB3泛素化修饰的靶蛋白，分析其在花衰老中的功能，揭示PhXB3调节花衰老的分子机理。①以PhXB3为诱饵蛋白，利用酵母双杂交方法初步获得PhXB3的互作蛋白。②沉默和超表达PhXB3基因，对其花瓣和对照进行蛋白组和泛素化修饰组测序分析，根据蛋白质水平和泛素化修饰水平的显著变化进一步确定PhXB3的互作靶蛋白。③BiFC和Co-IP等方法进一步证实PhXB3的泛素化修饰靶蛋白。④分离PhXB3泛素化靶蛋白编码基因的全长，并对其沉默和超表达，分析其在花衰老中的功能，建立 PhXB3调节花衰老的分子链条。本项目从蛋白质翻译后修饰角度研究衰老，对阐明花衰老的分子机理以及进一步对花卉保鲜品质改良具有重要意义。

矮牵牛E3泛素连接酶PhXB3可调节花衰老和叶片细胞死亡，但其分子机理未知。本项目发现矮牵牛PhXB3亚家族有3个成员，PhXB31a、PhXB31b和PhXB31c。结合前人研究，发现其中PhXB31a在花衰老过程中起主要作用。本项目利用酵母双杂交等技术筛选出矮牵牛PhXB31a的可能互作蛋白PhGRL1和PhACLB1。由于PhGRL1的功能我们课题组之前已经报道过（PhGRL1沉默加速了矮牵牛花瓣的衰老，Yang et al, 2015），因此我们主要开展PhACLB1的功能研究。PhACLB和PhACLA形成的ATP柠檬酸裂解酶复合体，催化细胞溶质乙酰辅酶A的形成。PhACLB和PhACLA沉默可以加速花瓣衰老，同时也改变了花色。出乎意料的是，代谢组学和乙酰组分析显示PaACLB沉默分别增加了矮牵牛花冠中乙酰辅酶A代谢的许多下游代谢产物的含量和许多蛋白质的乙酰化水平。PaACL沉默的矮牵牛花冠中乙酰辅酶A减少引起的代谢应激引起转录组、蛋白质组和乙酰组的整体和特异性变化，从而维持代谢稳态。在乙酰辅酶A缺乏的情况下，整体蛋白质组和乙酰组呈负相关。这些结果的结果表明，PaACL作为一种重要的代谢调节因子，通过促进转录组、蛋白质组和乙酰组的变化来维持代谢稳态。这些结果显示PhXB31a影响花瓣衰老的机理是：通过PhXB31a与PhGRL1和PhACLB1互作，导致其泛素化修饰和丰度改变，从而参与了衰老调节。本项目还发现乙烯处理会显著降低矮牵牛花冠的整体磷酸化水平，以及分别上调和下调了375和530个mRNA中400和603个m1A峰。另发现PCD相关基因PhDHS沉默延长了矮牵牛花的衰老。研究成果发表在Plant Physiology，Journal of Experimental Botany，Frontiers in Plant Science等期刊上。共发表7篇SCI论文。培养研究生7名，其中博士研究生1名，硕士研究生6名。