双功能连接酶Smurf1催化Neddylation的机制研究

Smurf1 is an E3 ubiquitin ligase belonging to the HECT family, which catalyzes the ligation of ubiquitin and substrate protein via its critical residue Cys699. In the investigations prior to this application, Smurf1 was also found to exhibit the activity of neddylation E3 ligase, making it the first HECT E3 with this catalytic activity. Although neddylation is a modification highly resembling ubiquitination, even sharing a couple of enzymes with each other, our previous studies showed that Cys699 of Smurf1 is not involved in the catalysis of the ligation in neddylation, suggesting that there are two distinguished catalytic centers in Smurf1. This project is aiming to, by the means of enzymology, biological chemistry and structural biology, further study the function of Smurf1 in catalyzing neddylation and to dedicate to elucidate explicitly the mode of the interactions between Smurf1 and the ubiquitin-like protein and the corresponding catalytic mechanism at an atomic level. Besides its remarkable scientific significance, this project will provide enzymatic and 3-D structural basis for the development of the anti-cancer drugs targeting neddylation and thus possess potential social and economic values.

Smurf1是HECT家族的E3泛素连接酶，通过其关键残基Cys699催化泛素与底物蛋白之间的共价连接。前期研究发现Smurf1同时具备类泛素化修饰Neddylation的E3连接酶活性，是第一个被确证具有该催化活性的HECT家族E3。虽然Neddylation是一种与泛素化极为近似的翻译后修饰，甚至共享一些催化酶，但是前期研究的结果显示，Smurf1的Cys699并未参与催化Neddylation的连接反应，提示该酶可能有两个功能不同的催化中心。本项目拟采用酶学、生物化学，以及结构生物学的手段进一步研究Smurf1在Neddylation中的功能，力争在原子水平上直观地揭示Smurf1与类泛素蛋白的相互作用方式，以及相应的催化机制。该项研究不仅具有重要的科学意义，还为靶向Neddylation的抗癌药物开发提供了酶学信息和三维结构信息，因而有着潜在的社会价值与经济价值。

Smurf1是HECT家族的E3泛素连接酶，通过其关键残基Cys699催化泛素与底物蛋白之间的共价连接。前期研究发现Smurf1同时具备类泛素化修饰Neddylation的E3连接酶活性，是第一个被确证具有该催化活性的HECT家族E3。我们的研究目标就是解析Neddylation修饰状态下的Smurf1或是其HECT结构域的结构，揭示Neddylation能够提高Smurf1的E3连接酶活性的机制，并鉴定Smurf1在催化Neddylation过程中的关键催化残基。我们首先成功建立起了体外的泛素化及Neddylation化的实验体系，并且生产制备出了Neddylation修饰状态下的Smurf1蛋白。然而，修饰过的Smurf1的蛋白量较少，虽然足以进行电泳或质谱的检测，但是远远不足以进行晶体学的结晶实验。因此，我们调整了研究方案，主要通过构建突变体来寻找关键残基，结果发现Smurf1的Neddylation很可能是一个自Neddylation的过程，不需要任何其他E3连接酶的参与。与此同时，我们也对Smurf1本身进行了结构生物学的研究，并且成功解析得到了小鼠Smurf1-HECT结构域的晶体结构。该结构与其他E3连接酶的HECT结构域有着一致的折叠，包括Nedd4以及Smurf2等等。对于这些HECT结构域的结构比对发现，Smurf1的关键残基的确应该是Cys699。本项目阶段性的研究成果将有助于彻底揭示Smurf1的催化机制。