受体介导的温敏性纳米载体对siRNA体内外传递及药效的影响和机制研究

树突状细胞（DC）是体内功能最强的专职抗原递呈细胞( APC)，唯一能够激活初始型T淋巴细胞并能有效激发机体CTL介导抗瘤免疫应答，故在抗肿瘤细胞免疫中起关键作用。未成熟DC因数量稀少，所以肿瘤相关抗原的DC靶向具有重要意义。DC表面特异性高表达DEC-205受体，泊洛沙姆不仅具有温度敏感性，且因其亲水性、较大空间位阻和佐剂样作用，可避免被巨噬细胞的吞噬。本项目旨在开发siRNA疫苗载体，深入研究负载siRNA的DEC-205修饰温度敏感性纳米载体的DC靶向摄取，探讨冷休克处理对摄取siRNA DCs内涵体的物理破裂及siRNA释放的影响；RT-PCR检测siRNA对EGFP mRNA表达干扰，Western blot检测对EGFP蛋白表达的影响；考察皮下注射siRNA-DCP-NPs对DCs的siRNA靶向摄取及基因沉默效果，为新型siRNA疫苗DC靶向纳米载体的研究提供创新思路及探索。

树突状细胞（Dendritic cells, DC）是目前所发现的功能最强的专职抗原递呈细胞(APC)，在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫中起关键作用。DC能直接激活初始型T细胞，通过体液免疫和细胞免疫作用使肿瘤细胞溶解，在多数情况下抑制了肿瘤生长。致敏的T细胞被活化为特异性的能杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞 ( CTL)，同时DC可介导体内免疫系统产生对肿瘤的免疫记忆。.本研究的主要内容包括：（1）温敏性泊洛沙姆接枝壳聚糖共聚物（Poloxamer-CS）的合成；（2）抗DEC-205-mAb修饰Poloxamer-CS纳米胶束(PMs)的制备及评价；（3）人外周血单核细胞来源的DC的分离培养与摄取实验；（4）siRNA-DCP-NPs对细胞增殖的影响；（5）冷休克处理对DCs细胞内涵体形态的影响；（6）siRNA-DCP-NPs对Bak mRNA表达干扰的影响；（7）siRNA-DCP-NPs对Bak蛋白表达的影响；（8）小鼠淋巴结内树突状细胞靶向性实验。.通过研究，目前完成了如下的研究工作。.(1) 阐明抗体修饰siRNA负载温敏性纳米胶束的DCs摄取机制。.DCs通过内吞作用摄取纳米胶束，并且是一个消耗能量的内吞过程。细胞摄取纳米胶束的主要途径网格蛋白介导的内吞，少部分是通过小窝蛋白介导。.（2）冷休克处理可致温敏性纳米载体膨胀，导致内涵体破裂，从而实现siRNA从内涵体逃逸。.（3）负载siRNA的DEC-205-Po-CS纳米胶束转染未成熟DCs后进行冷休克，目标蛋白的表达量明显下降降低。推测冷休克处理能有效促进siRNA从内涵体逃逸，在胞浆内发挥RNA干扰作用。.（4）DEC-205-Po-CS加冷休克组转染DCs后细胞存活率延长，与Western Blot和RT-PCR结果相一致。.（5）负载bak-siRNA的DEC-205-Po-CS的体内免疫活性检测结果，能提高DCs的IFN-γ的表达，显示载体包载促使siRNA的体内稳定性增加。.该研究为核酸疫苗的DCs靶向及免疫治疗提供了一定的理论和实验依据，但是对于siRNA的体内DCs靶向有待于进一步研究。