PCK1蛋白在衰老进程中的作用及其分子机制研究

The aging population has become an emerging burden in China. The molecular bases for aging processes are not fully understood. We previously performed the iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) analyses on physiological aging mice, and uncovered a handful proteins, including phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1), that were dysregulated during aging process. While silencing PCK1 promoted MEFs senescence, a recent study showed that PCK1 transgenic mice exhibited an extended lifespan, suggesting the potential role for PCK1 in aging. We therefore propose to investigate the impact of PCK1 on cellular senescence and aging by ectopic PCK1 expression and PCK1 knockdown. PCK1 Inducible knockout mice and transgenic mice will be generated to further investigate the roles of PCK1 on aging in vivo. In addition, potential PCK1 downstream targets and substrates will be identified through the combination of yeast two-hybrid , Co-IP and RNA Seq. The proposed study will provide novel insights into the molecular mechanisms of aging and aging-related diseases.

人口老龄化日益成为严峻的社会问题，有关衰老发生分子机制的研究显得十分紧迫而必需。我们前期利用iTRAQ蛋白芯片技术鉴定发现磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）等多个蛋白在生理性衰老小鼠中显著下调，并且沉默PCK1可促进MEF细胞衰老。此外，有研究表明，PCK1转基因小鼠可延长小鼠寿命，提示PCK1在衰老过程中发挥重要作用。本项目基于前期研究结果，进一步检测PCK1在不同月龄与不同代次MEF细胞中的时序表达；通过干扰以及过表达方法，在细胞水平研究PCK1对细胞衰老的影响；构建PCK1诱导性基因敲除及转基因小鼠，以在动物水平深入研究PCK1对衰老进程的作用。还将进一步通过酵母双杂交、蛋白质免疫共沉淀和RNA Seq等技术鉴定PCK1相互作用蛋白及相关信号通路，以深入阐明PCK1影响衰老进程的作用机制。本项目的研究对于理解细胞衰老发生的分子机制，深化认识衰老和衰老相关疾病的机制具有重大的意义。

人口老龄化日益成为严峻的社会问题，有关衰老发生分子机制的研究显得十分紧迫而必需。本项目利用高通量iTRAQ测序技术筛选在年轻和衰老小鼠肾组织中差异表达的蛋白，进一步验证鉴定衰老相关蛋白在不同衰老模型中的表达；在MEFs细胞中通过腺病毒和RNAi技术分别过表达或沉默糖异生关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）过表达及沉默对细胞衰老的影响；利用酿酒酵母这一模式生物构建PCK1缺失和过表达菌株，检测其对酵母复制性寿命的影响以及探讨其分子机制；通过培育PCK1条件性敲除和转基因小鼠，获得PCK1基因在肾脏中特异性敲除和过表达小鼠，检测其对小鼠寿命及其衰老相关指标的影响。 iTRAQ蛋白质谱测序结果显示，与年轻小鼠肾脏组织相比，在衰老小鼠肾脏组织有56个蛋白表达上调，6个蛋白表达下调。PCK1在衰老小鼠和早老小鼠肾脏组织中表达下调，而且PCK1在衰老和早老MEFs细胞的表达也下调。在年轻MEFs细胞中抑制PCK1的表达后，可显著促进MEFs细胞衰老、抑制细胞增殖，上调衰老相关蛋白p16的表达。在MEFs细胞中过表达PCK1后可延缓MEFs细胞衰老、促进细胞增殖，下调衰老相关蛋白p16的表达。经过转录组测序分析检测差异表达基因变化，通过KEGG通路富集分析，结果显示差异表达基因主要富集在p53信号路。PCK1基因缺失酵母菌株细胞增殖能力减弱，复制性寿命缩短，而过表达酵母菌株细胞增殖能力增强，复制性寿命延长。mRNA表达芯片筛选PCK1缺失菌株和野生型菌株中的差异表达基因，通过GO聚类分析筛选差异表达基因富集的代谢相关通路。通过定量PCR进一步检测糖异生相关基因表达明显下降，而糖酵解相关基因PFK1（6-phosphofructokinase subunit alpha）表达明显上升，同时糖异生生成的葡萄糖量减少，而糖酵解的中间产物丙酮和乳酸等含量上升。通过PCK1和PFK1的双缺失酵母菌株验证发现，PFK1缺失能回复PCK1基因缺失缩短的复制性寿命。PCK1肾脏特异性过表达小鼠寿命相对野生型小鼠有15%左右的延长，PCK1全身性敲除小鼠寿命只有一个月左右，而肾脏特异性基因敲除小鼠寿命也明显缩短。本项目的研究对于理解细胞衰老发生的分子机制，深化认识衰老和衰老相关疾病的机制具有重大.的意义。