生物膜介导中药耐药大肠杆菌的确证及其耐药质粒传递和调控的研究

In our previous research, small molecules Chinese herb-resistant Uropathogenic Escherichia Coli (UPEC) was isolated. But the mechanism is unknown. In preliminary experiments, the resistant plasmid was extracted and identified successfully. All strains of UPEC contained gene pga and luxS, which are encoded on the signaling molecules synthase of quorum sensing system in UPEC and the β-1-6-N-Acetyl-dextran aminesynthase, the major components of polysaccharide in biofilm. These two genes play an important regulatory role during the process of initial formation adhesion and maturation of the bacterial biofilm. Therefore, we hypothesized that biofilm-mediated resistance mechanism may exist. This project is aimed to UPEC，and is to research the two important regulatory genes luxS and pga operon in biofilm formation. In this study, the UPEC is separated clinically and resistant strains are selected. The resistant plasmid is extracted and identified. The capability of the biofilm formation and influencing factors to the biofilm formation from different medium are analyzed. We study the resistant plasmid transmission, regulation and its changes in luxS knockout strain. We also analyze the environmental influences to the expression of main regulation gene luxS and pga. Thus our hypothesis is proved and new research directions for reducing resistant genes spread are provided.

我们已分离出对中药小分子物质耐药的致肾盂肾炎大肠杆菌（UPEC）菌株，但机制不详。在预实验中，我们成功提取和鉴定了耐药质粒，所分离的菌株经PCR扩增均有pga和luxS基因，他们分别编码大肠杆菌群体感应系统信号分子合成酶和生物膜中多糖主要成分β-1-6-N-乙酰-葡聚糖胺合成酶，在细菌生物膜形成过程的初始黏附和生物膜成熟过程中有重要调节作用。因此我们推测，生物膜介导是耐药发生的机制。本项目针对UPEC生物膜形成的两个重要调节基因luxS和pga操纵子展开研究，收集临床分离的UPEC，筛选耐药菌株，提取和鉴定中药耐药质粒，对其形成生物膜的能力以及不同培养基对生物膜形成的影响因素进行分析，研究生物膜内耐药质粒的传递和调控以及luxS敲除株耐药质粒传递的变化，分析环境因素对生物膜主要调控基因luxS和pga的表达的影响，从而证明我们的假说，为减少中药耐药基因传播提供新的研究方向。

在既往的研究中，我们分离出对中药小分子物质耐药的致肾盂肾炎大肠杆菌（UPEC）菌株，根据已有的研究数据，我们推测，生物膜介导是耐药发生的机制。本项目针对UPEC生物膜形成的两个重要调节基因luxS和pga操纵子展开研究，结果发现：（1）通过对中药耐药株4996、5028、1351进行质粒的抽提，得到分子量为15000bp的质粒。感受态Trans10在6.2 g/L的中药平板上过夜未长出菌落，将提取的质粒转化至Trans10，接种在50g/L（MIC）中药平板上过夜后长出菌落，可见明显单克隆。经琼脂糖凝胶电泳证实，质粒在Trans10得到转化，鉴定为中药耐药质粒。结果说明：质粒介导是UPEC中药耐药发生的重要机制。（2）耐药UPEC菌株（1351，4996，5028）表现出非常相似的生物膜形成能力，且均较敏感菌株Trans10显著增强，表明菌株的中药耐药性与其生物膜形成能力密切相关。（3）在含0.5%葡萄糖的培养基中，菌株4996、5028均表现出相似的生物膜形成能力升高，但菌株1351表现出生物膜形成能力的显著减退，表明耐药菌株的生物膜形成能力，对于葡萄糖的存在反应不同。（4）耐药菌株1351、5028均呈现相似的pgaC、pgaD、luxS表达水平，但pgaA、pgaB的表达存在差异，与菌株5028的的高表达相比，菌株1351在含糖培养基条件下，pgaA和pgaB的表达受到部分抑制，其生物膜形成能力也相应减退，pga的基因表达水平与生物膜成膜能力具有一致性，说明pga是生物膜形成的效应基因。（5）标准株DH5α对外源耐药质粒pPICZA的摄取效率显著高于耐药菌株1351，菌株1351对质粒pPICZA的摄取效率在生物膜形成的8h-24h显著增加，细菌间质粒传递频率基本保持恒定，不受培养条件改变的影响。（6）luxS基因的缺失造成生物膜内质粒摄取能力下降，生物膜形成能力降低了约30%，表明luxS基因对于耐药菌株的生物膜形成并非必需，但可有助于生物膜的形成。以上研究结果提示：质粒和生物膜介导是UPEC中药耐药发生的重要机制；pga的基因表达水平与生物膜成膜能力具有一致性，是生物膜形成的效应基因；luxS基因对于耐药菌株的生物膜形成并非必需，但可有助于生物膜的形成；在生物膜形成的8h-24h，是UPEC耐药株摄取外源性耐药质粒的高峰时段。