石灰性紫色水稻土厌氧脱氮环节关键功能基因对不同施肥制度的响应特征

The relationship between soil microbes' functional gene diversity and nitrogen cycle of the farmland ecosystem is the highlight of re-evaluation of the soil quality and function. Calcareous purple paddy soil is an important agricultural soil resource in Sichuan province and China. For the purpose of maintaining its quality, a NPK Long Term Fertilization Experiment was established at Chuanshan, Suining city, Sichuan province in the 1980s. Based on this experiment station, modern molecular analytical methods such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), quantitative PCR and 454 high throughput sequencing will be used to evaluate the community structure, biodiversity and abundance based on the 16S rRNA and hzo gene of the anammox, and nirS/K and nosZ genes of the denitrification. The anticipated results will reveal mechanisms on how the functional genes in the two coupled anaerobic nitrogen removal processes(both anaerobic ammonium oxidation and denitrification) respond to different fertilization strategies, and the characteristics of functional gene distribution. The results will be useful for a better understanding of the nitrogen cycling in the paddy soil micro-ecosystem, to develop sound fertilization protocol, and will provide solid foundation for maintaining soil quality.

探索农田生态系统微生物功能基因多样性与氮素循环之间的关系，是重新评价农田土壤质量与功能的新切入点。石灰性紫色水稻土是四川乃至全国的一种重要农业土壤，为保护该类土壤，四川省于上世纪80年代在四川遂宁船山区建立了"NPK长期定位施肥"试验点。依托该平台，本项目拟结合变性梯度凝胶泳（DGGE）、定量PCR和454高通量测序等现代分子分析技术，对不同施肥制度下水稻土的厌氧氨氧化细菌16S rRNA基因和肼氧化酶（hzoA）基因，以及反硝化过程中的nirS/K和nosZ等功能基因的种群结构、多样性和数量特征进行分析。以期揭示水稻土厌氧氨氧化和反硝化过程的关键功能基因对不同施肥制度的响应特点及在土壤中的分布特征，以深入认识水稻土生态系统氮素循环特征，为在该类土壤上建立合理氮肥施用制度、保护土壤质量提供重要依据。

探索农田生态系统微生物功能基因多样性与氮素循环之间的关系，是重新评价农田土壤质量与功能的新切入点。石灰性紫色水稻土是四川乃至全国的一种重要农业土壤，为保护该类土壤，四川省于上世纪80年代在四川遂宁船山区建立了"NPK长期定位施肥"试验点。依托该平台，项目结合变性梯度凝胶电泳（DGGE）、末端限制性片段长度多态性、定量PCR和454以及Illumina MiSeq高通量测序技术，对淹水植稻期不同施肥制度下石灰性紫色水稻土的厌氧氨氧化细菌及反硝化功能基因nirS和nosZ的种群结构、多样性和丰度特征进行了综合分析。结果显示：长期定位施肥能够明显改变土壤理化性质、硝化作用及反硝化作用，更以化肥配施农家肥对土壤理化性质和生物学作用的影响更明显。硝化作用和反硝化作用发生的主要土壤层次是0-20cm。相对无肥CK，长期定位施肥会提高土壤反硝化功能基因nirS和nosZ的表达量，尤以化肥配施农家肥作用更明显。nirS基因表达量介于1.4×104-9.6×105 copies g-1之间，而nosZ基因介于1.1×105-1.9×107copies g-1。表层0-20cm是反硝化功能基因的主要分布层次，土壤深度增加，基因表达量降低。系统发育分析显示nirS型反硝化细菌类群主要属于Dechlorospirillum，磁螺菌属（Magnetospirillum），黄杆菌属（Flavobacterium）和假单胞菌属（Pseudomonas）。而nosZ型反硝化细菌类群主要属于α-变形菌门的固氮螺菌属 (Bradyrhizobiaceae) 和慢生根瘤菌属 (Rhodospirillaceae)，少部分为β-变形菌门。土壤anammox细菌16S rRNA基因表达量介于4.44×102-3.17×105 copies g-1之间，N肥处理下的16S rRNA基因表达量拷贝数最高，而CK处理下的最低。表层0-20 cm是anammox 16S rRNA基因表达的主要层次，20-40 cm深度处表达量最少。Brocadia属是石灰性紫色水稻土优势厌氧氨氧化菌，Anammoxoglobus属在各个层次中均有出现，Scalindula属anammox细菌出现在20-40 cm、40-60 cm、60-90 cm 3个层次，而Jettenia属只在L1层次出现。不同施肥制度下石