从调控miRNA及凋亡相关靶基因探讨清胰化积方逆转胰腺癌化疗耐药的机理

胰腺癌化疗耐药是临床治疗难点，课题组提出"湿热毒聚"是胰腺癌发病的核心病机和耐药内因。临床研究证实，针对该病机组方的清胰化积方联合化疗疗效显著优于单纯化疗，实验研究揭示该方对吉西他滨化疗的增效作用与凋亡机制介导的耐药逆转有关。异常表达的miRNA可通过对靶基因如Bcl-2、PTEN、p27kip1的转录后调节控制凋亡相关信号通路，影响肿瘤细胞对化疗的敏感性。清胰化积方逆转化疗耐药的作用是否通过调控miRNA及凋亡相关靶基因/蛋白表达，诱导耐药胰腺癌细胞的凋亡而实现？本项目拟建立胰腺癌耐吉西他滨细胞株BxPC-3/GEM，体内实验观察清胰化积方逆转BxPC-3/GEM耐药性的效果，及其调节BxPC-3/GEM耐药相关miRNA、诱导凋亡及调控相关靶基因/蛋白表达的作用，探讨清胰化积方提高耐药胰腺癌化疗敏感性的原因和机理。

本研究采用间歇浓度梯度倍增法诱导建立了人胰腺腺癌吉西他滨耐药细胞株SW1990/GEM，与亲本细胞株SW1990比较，具有细胞倍增时间减慢、G0/G1期阻滞的特点, 耐药指数RI为764。分别提取SW1990/GEM及SW1990的RNA-seq和miRNA-Seq，应用测序法检测其表达，计算出差异表达的mRNA及miRNA。生物信息软件预测筛选出的差异表达miRNA的潜在靶基因，并与mRNA测序部分得到的差异基因进行交集分析。结果发现，SW1990/GEM细胞中miR-643、miR-1261等28个miRNA表达上调，miR-3676、miR-4455、miR-4644、miR-4650等28个miRNA表达下调。有1057多个mRNA有差异性表达，涉及药物反应、细胞凋亡、细胞自噬、细胞周期等功能。联合分析获得了起核心调控作用的6个miRNA和16个被这些miRNA调控的关键靶基因，构建了miRNA与靶基因的调控网络。建立SW1990/GEM及SW1990裸小鼠皮下移植瘤模型，以清胰化积方、吉西他滨及联合用药进行干预，发现清胰化积方对胰腺癌具有逆转化疗耐药的作用，与化疗联合具有协同作用。其作用机制可能与下调耐药相关miRNA如miR643及其下游靶基因、上调凋亡相关靶基因PTEN、下调凋亡相关靶基因BCL-2，从而提高胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性有密切关系。本研究采用体内外实验，证实了清胰化积方逆转胰腺癌化疗耐药的作用，并从调节耐药相关miRNA及其靶基因角度对其作用机制进行了深入探讨。本研究成果为进一步优化清胰化积方组方和完善清胰化积方为主的胰腺癌综合治疗方案、改善这一临床难治性恶性肿瘤的疗效奠定基础，并对阐明中医药抗肿瘤治疗中化疗“增效”现象的机理研究提供新思路和新方法。相关研究成果已形成多篇论文，并被SCI期刊录用，及在国内外会议进行论文交流。