化脓隐秘杆菌β-内酰胺类抗生素耐药导致的PBPs氨基酸变化对毒力影响的研究

Trueperella pyogenes (T. pyogenes) is a Gram-positive bacteria locating on the surface of mucous membrane in the animal, and can cause a suppurative infection to many organs in many domestic animals, such as cow, sheep, swine and so on. Recently, this bacteria has become resistant to many kinds of antimicrobial agents especially β-lactams, and the studies indicated that the substitutions on PBPs were relevant with the emergence of β-lactams resistance in bacteria. Virulence plays an important role in infection caused by bacteria, therefore it is crucial for illustrating the mechanism of antibiotic resistance to study the influence of the substitutions of PBPs on virulence in T. pyogenes. In this study, PCR will be hired to amplify the pbp genes of T. pyogenes, and the substitutions of PBPs will be analyzed after sequence analysis of pbp genes. And the ATCC 19411-pUC-pbp mutants will be constructed according homologous recombination to identify the influence of the changes in sequence of amino acids in PBPs on virulence in T. pyogenes. The expression of virulences including PLO, NanH, NanP, and CbpA will be measured by western blot in mutants, and the cellular morphology will also be observed. Besides, in order to determine the pathogenicity of mutants, the adhesion to HeLa cells and pathogenicity to mice will be carried out. Finally, the research will illustrate the the influence of PBPs substitutions on virulence in T. pyogenes, which will be beneficial to study the effect of β-lactams resistance on virulence in T. pyogenes.

化脓隐秘杆菌是位于动物黏膜表面的一种革兰氏阳性菌，常引起多种动物如牛、羊、猪等多器官的化脓感染。近年来，化脓隐秘杆菌对抗菌药物特别是对β-内酰胺类药物耐药性日益严重，而该类药物耐药跟PBPs变化密切相关。毒力因子是细菌致病的关键因素，研究化脓隐秘杆菌PBPs变化对毒力的影响，对阐明化脓隐秘杆菌耐药机制具有重要意义。本研究利用化脓隐秘杆菌分离株，采用PCR方法扩增对β-内酰胺类抗生素耐药菌株的pbp基因，预测PBPs氨基酸变化情况；采用同源重组技术，构建化脓隐秘杆菌ATCC 19411-pUC-pbp菌株。分析重组菌株的PLO、NanH、NanP和CbpA等毒力因子的表达量变化；观察重组菌株细胞形态变化；测定菌株对HeLa细胞的黏附力和对小鼠的致病力，分析菌株的致病力变化情况，阐明化脓隐秘杆菌PBPs氨基酸变化对毒力的影响，为研究化脓隐秘杆菌β-内酰胺类抗生素耐药对毒力的影响奠定基础。

抗菌药物是治疗化脓隐秘杆菌所致感染的首选药物，然而由于抗菌药物的广泛使用，甚至是滥用，导致化脓隐秘杆菌分离株的耐药性越来越严重。细菌耐药性的产生不仅能够使抗菌药物的临床应用效果下降，还能导致细菌一些生物学特性的改变，如毒力因子。本课题组前期研究表明，化脓隐秘杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药能够影响其毒力基因nanH的表达，提示化脓隐秘杆菌β-内酰胺类抗生素的耐药可能影响化脓隐秘杆菌的毒力，而pbp基因的突变是导致化脓隐秘杆菌对β-内酰胺类抗生素的主要机制之一，对化脓隐秘杆菌全基因组测序结果表明，编码化脓隐秘杆菌PBP的基因分别为pbp1a、pbp2b和pbp2，并且基因序列发生了不同程度的突变，进而引起PBPs的氨基酸序列发生变化。因此，本研究以化脓隐秘杆菌为对象，研究细菌耐药性和毒力因子之间的关系。本研究利用同源重组技术构建化脓隐秘杆菌pbp1a、pbp2b和pbp2基因突变菌株，采用western blot测定化脓隐秘杆菌pbp基因突变菌株的PLO、NanH、NanP和CbpA的表达量、生长曲线、细菌形态，并通过小鼠试验测定化脓隐秘杆菌pbp基因突变菌株的致病力。研究结果表明，与标准菌株ATCC19411相比，化脓隐秘杆菌PBPs氨基酸突变菌株的生长速率没有明显变化，另外，NanH的表达量显著下降，同时NanP和CbpA也呈现下降趋势，而PLO的表达量则没有明显变化；PBP1a氨基酸突变菌株对HeLa细胞的黏附力和对小鼠的致死率显著下降，菌体形态比标准菌株更短、宽。另外，化脓隐秘杆菌PBP2b氨基酸突变菌株的生长曲线、毒力因子PLO、NanH、NanP和CbpA以及菌体形态等较标准菌株ATCC19411没有明显变化。最后，化脓隐秘杆菌PBP2氨基酸突变菌株较标准菌株ATCC19411的生长速率和对小鼠的致死率明显下降，但是，毒力因子PLO、NanH、NanP和CbpA的表达量没有明显变化，PBP2氨基酸突变菌株的菌体形态变得更短，同时边缘更加陡峭。通过本研究揭示了化脓隐秘杆菌β-内酰胺类抗菌药物导致的PBPs氨基酸变化对毒力的影响，为深入研究化脓隐秘杆菌耐药性与毒力的关系，及对临床合理用药有效治疗化脓隐秘杆菌感染奠定理论基础。