利用CRISPR/Cas9技术研究大豆gma-miR160家族成员的功能

Gma-miR160 plays an important role in soybean growth, symbiotic root nodules and response to stress, gma-miR160 family consist of more than one member, the function of which were not researched until now. This study plans to construct a CRISPR/Cas9 technology system with less off-target effects using Cas9 variant after screening. To further improve editing efficiency of CRISPR/Cas9 technology in soybean, the highest activity soybean U6 promoter, being compared to other predicted U6 promoters, was selected to activate the sgRNA expression. To analyze the function of gma-miR160 member, each of which was respectively disturbed by using the optimal CRISPR/Cas9 system. Expression of gma-miR160 and its targets were detected in soybean mutants, which were observed and identified under some stress. In this research, an efficient CRISPR/Cas9 system with less off-target effects was expected to be constructed, which could be beneficial to reveal the function of gma-miR160 family member and provide theory, technology, material for soybean breeding.

大豆gma-miR160影响植物生长发育、根瘤共生及逆境胁迫应答，gma-miR160家族由多个成员组成，有关大豆gma-miR160家族成员功能的研究未见报道。本研究拟对Cas9进行筛选，利用Cas9突变体构建低脱靶效应的CRISPR/Cas9技术体系。通过比较预测的大豆U6启动子活性，选择活性较强的大豆U6启动子驱动sgRNA表达，进一步提高CRISPR/Cas9技术对大豆基因的编辑效率；利用低脱靶效应的CRISPR/Cas9体系分别干扰大豆gma-miR160家族成员的表达，在突变体内检测gma-miR160及其靶位表达变化，鉴定其逆境胁迫能力，分析大豆gma-miR160家族成员的功能。本研究旨在创建高效的、具有较低脱靶效应的CRISPR/Cas9体系，阐明大豆gma-miR160家族成员的功能，为大豆新品种培育提供理论、技术及材料支持。

sgRNA是CRISPR/Cas9基因编辑体系的重要组成元件，利用高活性的U6启动子驱动sgRNA的表达能够提高CRISPR/Cas9基因编辑体系的效率。为此，我们在大豆全基因组水平预测、克隆了11个大豆U6启动子，基于11个大豆U6启动子构建了不同的表达载体，以其筛选活性较强的大豆U6启动子。分别通过大豆发状根体系及转化拟南芥的途径，利用qRT-PCR比较了11个U6启动子驱动截取GUS的表达，结果表明GmU6-4，GmU6-7，GmU6-8，GmU6-10 与GmU6-11 的活性较高；此外，还选取了大豆三个内源基因Glyma03g36470，Glyma14g04180与Glyma06g136900为靶标，通过转化大豆发状根途径表明基于11个不同的大豆U6启动子的CRISPR体系对可以诱导大豆内源基因产生碱基缺失、插入或颠换的突变类型，基因突变率介于2.8%-20.6%，其中基于GmU6-8与GmU6-10的 CRISPR体系的基因编辑效率最高，分别为20.3%与20.6%，其中基于GmU6-8与GmU6-10启动子驱动截取GUS的表达效率也比较高。综上所述：具有较强的启动子活性，能够提高CRISPR/Cas9体系的基因编辑效率。基于GmU6-8与GmU6-10的启动子的CRISPR体系具有较高的基因编辑效率，为研究大豆基因功能提供技术体系。