精子SSP411缺失表达致早胚卵裂延迟的分子机制

ssp411 is a novel gene cloned from rat in our lab, its gene products (mRNA and protein) could be detected specially in spermatids and mature sperms of rat, mouse and human. Our previous studies indicate female ssp411 knock-out mice are fertile, while males suffer from oligo-asteno-teratozoospermia and sterility. Cleavage is a period of rapid division of zygote, the early activities of cleavage is generally thought to be governed by mother's genomic products deposited in the egg. However, we find that ssp411-defect sperms could fertilize mouse eggs via ICSI procedure, but delay the subsequent cleavage of zygote, which suggests that ssp411 is a possible sperm factor that can activate cleavage. In this project, we will carry out following basic studies: 1) by using ssp411-defect mouse model, we will evaluate the detailed functions of ssp411 on cleavage of early embryo; 2) with monoclonal antibody prepared in our lab, the project will study the molecular mechanism of function of SSP411 protein; 3)via molecular biology stretagies,such as methylation profiling of promoter by pyrosequencing, we will study the expression regulation of ssp411 gene. Moreover, we screen samples in our human sperm bank, and find that loss or low level of SSP411 occurrs in 7% of sterile males. With these sperm samples, we will study the silence mechanism of human ssp411 gene and its functions on human zygote cleavage. This project will elucidate the molecular mechanism of male sterility caused by ssp411 defect, and provide novel diagnostic and therapeutic strategies for clinic approaches.

ssp411是我们克隆的一个新基因，特异地在性成熟大鼠、小鼠和人睾丸及附睾精子中表达，但其功能尚不清楚。我们前期研究发现，该基因敲除小鼠雌性正常而雄性不育，表现为精子少、弱。受精卵的快速有丝分裂称为卵裂，一般认为卵裂速度主要与卵质有关。有趣的是，我们通过ICSI发现，精子缺失ssp411致早胚卵裂异常，提示该基因可能是一个激活卵裂的精子因子。在本申请项目中，我们将利用基因敲除小鼠模型，进一步鉴定SSP411在早胚卵裂中的功能；利用自制单抗免疫共沉淀鉴定其相互作用蛋白，深入研究SSP411的分子机制；通过鉴定启动子DNA甲基化模式等研究该基因的表达调控。此外，我们发现约7%不育男性精子中SSP411表达低或缺失，我们将进一步鉴定该基因在不育患者精子中沉默的分子机制、异种受精研究其在人卵裂中的功能机制。项目研究获得结果将揭示精子蛋白SSP411调控卵裂的分子机制，并为相关不育症提供新诊治方法。

SSP411在精子发生各阶段的表达特征我们前期已鉴定，但其在卵子及各期早胚中的表达尚未知。我们首先对小鼠卵子及各期胚胎中Ssp411 mRNA表达水平进行了分析鉴定，发现其在卵母细胞中不表达，但在受精后的原核期即出现表达，4-8细胞期则达到最高水平。利用基因敲除小鼠模型，我们发现SSP411缺失表达的精子通过ICSI后能正常受精，但胚胎第一次卵裂延迟，且囊胚率低，囊胚细胞数目显著下降，内细胞团增殖能力减弱，胚胎移植后出生率低，由于SSP411抗体的特异性和灵敏度均不够理想，蛋白水平的工作一直未能顺利展开，我们因此构建了在SSP411 N-端和C-端分别带HA标记的HA标记SSP411小鼠模型，用于研究SSP411在早胚发育阶段的蛋白表达特征，深入研究SSP411导致胚胎卵裂延迟的分子机制。.本研究利用蛋白芯片技术，发现有245个蛋白可能与SSP411有相互作用。鉴于精子形成过程与泛素-蛋白酶体降解途径（UPP）关系密切，且我们发现SSP411蛋白缺失表达后导致精子蛋白泛素化水平升高，因此本研究重点验证与UPP途径相关的PSMC3蛋白，一种26s蛋白酶体调节亚基，是否与SSP411有直接的交互作用，通过CO-IP实验，我们证实PSMC3与SSP411蛋白具有直接的相互作用，其参与调控精子头部成型的manchette结构，我们发现SSP411缺失表达后导致精子畸形。.为说明SSP411缺失表达的临床意义，我们通过比较分析了少弱畸形精子症患者的精子与正常人精子的SSP411蛋白的表达情况，结果发现，少弱畸形精子症患者中普遍存在SSP411蛋白低表达或不表达的情况。我们还发现人ssp411基因有多个转录异构体同时存在，精子中除了正常的ssp411 mRNA外，还存在有32bp插入的异常转录剪接体，其mRNA存在PTC-STOP区域且其蛋白表达低或不表达。我们通过细胞转染试验，证明hsa-mir-361-3p通过结合PTC-STOP区域，抑制了该转录本翻译成蛋白，畸形精子症患者中SSP411的低表达或不表达是否与其mRNA中仅存在异常转录剪接体尚需要我们扩大样本量后验证。.我们的研究表明，SSP411的表达特异性以及其对精子形成以及早胚发育阶段的作用，可为男性不育诊断和治疗提供新的理论基础和方法策略，其临床意义值得我们更深入地研究该蛋白的分子机制。