微生物β-葡聚寡糖最小功能单元的挖掘及其构效关系研究

β-葡聚糖的活性中心-β-葡聚寡糖与补体受体3蛋白（CR3）的特异识别是引发机体产生抗肿瘤效应的关键途径之一，然而β-葡聚寡糖片段与CR3蛋白之间的作用机制与构效关系目前并不十分清楚。我们在已经拥有部分葡聚寡糖探针基础上，拟通过对五种产不同β-葡聚寡糖的微生物进行发酵、提取，获得不同结构的高纯度β-葡聚糖，再对获得多糖进行水解从而获得一系列短链β-葡聚寡糖，以这些短链β-葡聚寡糖作为探针，运用糖芯片技术，筛选获得与功能信号蛋白CR3特异结合的最小寡糖片段，结合质谱, NMR等手段，探索寡糖探针分子的结构及它们与CR3蛋白相互作用的结合力关系、结合位点和结合模式等问题，从而在微尺度水平阐明CR3蛋白与β-葡聚寡糖的识别机理，获得CR3蛋白与β-葡聚寡糖功能单元的构效关系规律，为以CR3蛋白为靶点的高效抗肿瘤功能糖的设计、筛选提供理论依据和新思路。

功能糖寡作为功能食品配料当中的重要品种已经大量应用于食品工业。制备和筛选新的寡糖成为功能寡糖研究的主要方向。本项目从真菌子实体中多糖的提取开始，研究了香菇子实体，灰树花子实体中多糖的分级精制和结构表征工作。通过酸解获得了一系列葡聚糖。同时对部分多糖进行了寡聚化，获得系列寡糖。此外，主要是探索了由热凝胶制备线性β-1,3-葡寡糖的不同方法（1）化学降解法：150 g•L-1热凝胶溶解在二甲亚砜中80 ºC时酸解制备线性β-1,3-葡寡糖，并建立了有机溶剂分级沉淀分离线性β-1,3-葡寡糖的方法，对10 g•L-1热凝胶水解液，2.0和4.7倍体积的二氯甲烷或2.2和3.4倍体积乙酸乙酯可以沉淀线性β-1,3-葡寡糖；（２）酶降解物法：在建立了提高热凝胶颗粒在水解体系中稳定性的方法基础上，摸索并建立了内切β-1,3-葡聚糖酶的纯化方法并对纯化后内切酶的蛋白和酶学性质进行了测定，同时用该内切酶获得了不同聚合度的寡糖，采用该策略，低聚合度热凝胶寡糖（Mw<1000 Da, DP 2-6）和高聚合度寡糖（DP 7-10）总含量比常规条件下分别提高了49.4%和58.8%；（３）研究了哈茨木霉发酵生产内切β-1，3-葡聚糖酶的工艺，并将发酵产物直接用于产葡聚寡糖的研究；（4）研究了哈茨木霉和热凝胶产生菌株混合发酵产寡糖的工艺。在功能挖掘方面：（1）考察了热凝胶寡糖诱导马铃薯叶片细胞产生防御响应的效果。测定结果显示，结果表明热凝胶寡糖激活了马铃薯细胞的防御响应，然而响应水平随着诱导时间延长逐渐下降，20 d后恢复至诱导前水平。进一步测定发现，热凝胶葡五糖是显著激活马铃薯防御响应的最小β-1,3-葡寡糖单元。（2）对经热凝胶寡糖诱导12 h后表达量明显上调的10种蛋白进行了鉴定和功能分析；考察了微型马铃薯植株经热凝胶寡糖诱导后对致病疫霉的防御抗性效果。结果表明 P. infestans或寡糖处理对马铃薯粒重影响并不显著。但热凝胶寡糖短期处理使得马铃薯植株对P. infestans的抗性增强。（３）以草莓为研究对象，分别灌根、喷施、灌根加喷施β-1,3-葡寡糖，β-1,3-葡寡糖能够诱导草莓抗病、提高果实保鲜和品质。本研究项目的开展为水不溶多糖的水解策略提供了可借鉴的方法与技术体系。将加速寡糖多样化和功能开发与挖掘。