基于螺旋光束三维纳米分辨的活细胞动态功能成像方法研究

In recent years, the resolution, include lateral and axial, of nano-resolution imaging microscopy based on fluorescence molecular switch effect and molecular localization has broken through the diffraction limit. The three-dimensional nano-resolution microscopy combined with double helix point function is currently one of the more promising methods. This method using the point spread function transformation to obtain axial localization from two rotation spots, imaging depth can achieve 4um, and the axial resolution of up to 10~20nm, to meet the requirements of most of the living cell imaging. However, the two spots detection caused large energy loss, and to avoid crosstalk, the sparse label of sample also restrict the imaging process in living cell, which effect the further expansion of application. This project mainly aims to develop a new method of three-dimensional nano-resolution imaging based on corkscrew beam. In the same axial depth conditions, we only need one spot, according to its rotation characteristics can obtain axial position. This method has higher energy usage ratio, and allow the density of the luminous molecule achieve 2 times more than that of the DH-PSF under the same positioning precision without crosstalk. Combined with single molecule localization, this method is expected to provide a three-dimensional high-resolution imaging method for the biologists.

近年来基于荧光分子开关效应和分子定位的纳米分辨成像方法的横向和轴向分辨率早已突破了衍射极限，其中结合双螺旋点扩展函数（DH-PSF）方法的三维纳米分辨方法是目前比较有前景的方法之一。该方法是利用PSF改造获得具有连续旋转的两个光斑来实现轴向分辨，轴向深度达到4μm，目前已获得了高达10~20 nm的轴向分辨率，满足大部分活细胞成像要求。然而采用该方法的缺点是产生两个光斑造成大的光能损失，并且要求样品足够稀疏才能避免光斑串扰，使得在活细胞成像过程中十分受限，不利于该方法的进一步扩展应用。本项目旨在发展一种新型的基于单个螺旋光束的三维纳米分辨成像方法，在获得同样轴向深度下，只产生一个光斑即可根据其旋转特性来实现轴向定位。该方法能够更有效的利用有限光能量，在相同定位精度下，发光分子的密度达到DH-PSF的2倍以上也不会发生串扰，结合单分子定位有望为生物学家提供一种三维纳米分辨的高精度成像方法。

活细胞内研究其亚细胞结构以及细胞器和分子之间或不同分子之间的相互作用关系是生命科学研究面临的主要挑战，对于研究生命过程中的分子机制具有重要意义。本项目主要围绕基于螺旋光束的三维纳米分辨的成像新方法，用于完整细胞的高精度三维纳米分辨成像，我们搭建了一套基于螺旋光束的三维纳米分辨的单分子纳米分辨显微成像系统，通过实验系统的测试和标定，获得系统测试分辨率达到了（21 nm，23 nm，33 nm）；利用稀疏贝叶斯学习的MSIM 超分辨图像重构方法研究，搭建了MSIM系统并编写了数据处理程序，在此基础上，将基于多重测量矢量模型的稀疏贝叶斯学习算法用于MSIM系统的超分辨图像重构，通过计算机模拟实验和生物样品成像实验证实了该方法能够实现90nm的横向分辨率，是传统MSIM 横向分辨率的1.5倍，结合双螺旋相位调制的MSIM，实现成像区域的三维样品结构和深度信息的恢复，单次扫描获得2μm深度范围内的三维样品超分辨结构信息。在完成本课题目标的同时，探索三维荧光功能成像，在活细胞条件下获取三维荧光强度信息的同时也能得到荧光寿命信息，能够反映活细胞内微环境变化，为研究者提供更有效的工具。