miR828/miR858介导的番茄果实花青素生物合成调控网络的研究

花青素具有抗衰老和抑癌等功效，提高番茄果实花青素含量可提高人类健康水平。miRNA是基因表达的重要调控因子。本课题组先期研究已获得miRNA调控拟南芥花青素合成的实验证据，筛选出一组调控该途径的miRNA。其中，miR828和miR858是两个功能未知的新miRNA。软件预测它们的靶基因分别是调控花青素合成的PAP1/MYB75和MYB12。本项目以番茄为试材，采用STM和two-hit poly-cis miRNA等新技术创建miR828和miR858及其所作用靶基因的过量和减低表达番茄转基因株系，然后通过表型分析、花青素含量的测定等实验探讨miR828和miR858的功能，解析miRNA828和miR858介导的番茄果实花青素合成调控网络，建立基于miRNA提高番茄果实花青素的新策略。研究结果可丰富有关miRNA与植物代谢调控的理论知识，为其它次生化合物的植物代谢工程提供有益的信息。

MicroRNA （miRNA）是一类20-24核苷酸长的单链非编码小RNA，主要通过与靶基因mRNA的互补配对在转录后水平负调控靶基因mRNA的转录或翻译。诸多研究表明植物microRNA参与生长发育调控，并在逆境胁迫和次生代谢中发挥着重要的作用。miR828和miR858是近期通过深度测序发现的两个新miRNA，相关功能研究鲜有报道。含有9个成员的miR165/166是一个非常保守的家族，模式植物拟南芥的研究表明，该家族miRNA能靶向调控HD-ZIPⅢ转录因子家族的5个成员。已有研究显示miR165/166以及HD-ZipIII家族成员在拟南芥生长发育过程中扮演着相互重叠、相互依赖又相互竞争的作用。因此，单独突变miR165/166或者HD-ZIPⅢ家族中的任何一个成员都不能全面认识它们的生物学功能。有关番茄miR165/166的功能研究还未见详尽报道，是否参与花青素生物合成调控尚不清楚。STTM技术可同时高效特异地降解或阻遏体内目标小RNA家族所有成员，是一种新的通过功能缺失解析miRNA功能的强有力方法。本研究以番茄和拟南芥为材料，分别应用过表达这三个miRNA和应用STTM沉默这些miRNA等实验方法，系统研究了miR828、miR858和miR165/166及其靶标基因对植物生长发育的影响，特别是参与花青素生物合成的调控机制。.首次在番茄中鉴定了miR828、miR858及其靶标基因，并通过功能获得和功能缺失表达载体的构建、番茄遗传转化、表型分析、花青素含量测定以及花青素合成相关基因表达检测等一系列实验阐明miR828、miR858和miR165/166均在转录后水平负调控番茄花青素的生物合成。miR828还参与植物缺磷胁迫反应调控。同时，应用STTM165/166技术及其拟南芥和番茄遗传转化，本研究发现miR165/166一些新功能。miR165/166不仅调控植物生长发育，而且在生长素信号通路和非生物胁迫调控网络中起着重要作用，研究结果丰富了有关植物花青素生物合成调控分子机制的理论和miRNA介导植物基因表达调控网络的知识体系，为建立基于miRNA遗传修饰花青素合成途径提供实验依据和基因工程新策略。