疏水电荷诱导型高效液相色谱机制及应用研究

Liquid chromatography with high resolution and high biocompatibility for protein analysis and separation is one of research targets which are urgently demanded in biotechnology. Hydrophobic Charge Induction Chromatography (HCIC) with hydrophobic and electrostatic ligand which developed in Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) is introduced to High Performance Liquid Chromatography (HPLC), forming a new chromatography mode of High Performance Hydrophobic Charge Induction Chromatography (HPHCIC) which is recognized as high resolution, dual interation mode and high biocompatibility. According to this chromatography mode, the project is going to design and prepare a series of HPHCIC ligands; find the relationship between target protein component and suitable ligand and the relationship between protein characteristics, ligand structure, mobile phase composition and retention factor; analyse the characteristics of thermodynamics and retention model in retain process; explore the chromatography mechanism through protein conformation research and molecular simulation. At last, HPHCIC will be apply to analyse and separate the analogous protein components, which can feedback the chromatography performance and application value. This project is aimed at proposing the new chromatography mode of HPHCIC, which gives a new method for protein fine analysis and separation.

高分辨率、高生物相容性蛋白质液相色谱分析和分离技术是生物技术中迫切需求和亟待发展的研究目标之一。在高效液相色谱(HPLC)中引入当前在快速蛋白质液相色谱中崭露头角的疏水电荷诱导色谱技术(HCIC)，利用HCIC的疏水和电荷双重作用，形成高分辨率、双分离模式和高生物相容性的疏水电荷诱导型高效液相色谱（HPHCIC）。项目针对新型HPHCIC色谱模式，设计性能可控的系列潜在配基，建立目标蛋白质混合组份与最适色谱填料的潜在对应关系；建立蛋白质性质、功能配基特征、流动相组成等与保留因子的关系，分析保留过程的热力学性质以及新型色谱模式的保留模型新特征；通过蛋白质构象研究与分子模拟技术分析色谱机理；最后将HPHCIC应用于结构类似蛋白质组份的分析和分离，反馈色谱性能和应用价值。本项目旨在提出一种新型HPHCIC色谱模式，为蛋白质的精细分析和分离提供一种新思路和新方法。

蛋白质的高效液相色谱(HPLC)是重要的一种高分辨率蛋白质分离和分析的方法。项目将疏水电荷诱导色谱技术(HCIC) 引入到HPLC中，利用HCIC的疏水和电荷双重作用，形成高分辨率、双分离模式和高生物相容性的疏水电荷诱导型高效液相色谱（HPHCIC）。项目从大孔硅胶微球出发，以KH560为活化剂，以巯基和氨基为反应基团进行杂环配基的偶联，获得以巯基吡啶，氨基吡啶、巯基咪唑、巯基苯并咪唑为配基的四种HPHCIC介质，填装之后研制成四种HPHCIC色谱柱。项目以牛血清白蛋白、溶菌酶和牛初乳抗体为模型蛋白质，对模型蛋白质在HPHCIC色谱柱上的保留行为进行考察。分析了流动相pH、流动相中乙腈含量、流动相的盐浓度与保留因子之间的相互关系，理清了不同色谱柱的性能特征。通过考察均一流动相pH、流动相pH梯度（ΔpH）以及盐和有机溶剂引入流动相等色谱条件下混合模型蛋白的色谱分离情况，结合蛋白质的保留行为，获得了四种HPHCIC色谱柱的分离性能。同时，借助圆二色（CD）光谱和蛋白质荧光光谱方法，通过不同流动相条件下模型蛋白的结构研究，阐明了模型蛋白在pH、乙腈含量、盐浓度等条件变化下的结构变化，对应HPHCIC配基的理化性质，验证了其保留行为产生的根本原因，即在理论上提出了蛋白质在HPHCIC色谱柱上的保留机理。最后，利用HPHCIC对大肠杆菌表达rProtein A蛋白进行了分析和分离，获得了良好的鉴定和分析效果。本项目提出了一种新型HPHCIC色谱模式，为蛋白质的精细分析和分离提供一种新思路和新方法。