核转录因子Nrf2的缺失或持续激活对骨代谢影响机制的研究

It is known that skeleton is highly sensitive to external forces and mechanical stimulation. Moderate external forces and mechanical stimulation can promote bone formation. However, the precise mechanisms underlying this response are not fully understood. Loading increases mitochondrial activity，and may increase both oxidative stress and antioxidants in bone cells. Nrf2 has been considered as a master regulator of cytoprotective genes against oxidative and chemical insults. We found that the bone volume and bone formation of Nrf2 mice were dramatically reduced compared to the control group. By using age-matched Nrf2 knockout (KO) and Keap1 knockout (KO) littermate mice and the cultured osteoblast cells, we test the role of Nrf2 signaling in load-induced bone response. In addition, RNA from tibia and femur bones will be collected and whole transcriptome sequencing (RNA-Seq) will be utilized to detect gene expression profile. Protein related to oxidative stress, such as ROS, OPN and OPG, will be examined to furthermore identify that Nrf2 enhances load-driven bone formation through suppression of oxidative stress responses. Understanding the role of Nrf2 in bone anabolic response will prove new therapy targets for clinical bone metabolism.

骨的生长对外力的改变及机械刺激高度敏感，适量的外力及机械刺激可促进骨形成，然而其作用机制尚不明确。最新观点认为负荷（运动）既可增加骨细胞内线粒体的活性，又可激动骨细胞的氧化应激反应和抗氧化作用。Nrf2被认为是一种具有抗氧化和抵抗化学刺激作用的细胞保护因子。我们前期实验发现Nrf2 KO小鼠的骨体积和骨形成与对照组相比均显著降低，说明Nrf2缺失可抑制骨形成。本研究采用杂交饲养获得在体Nrf2(-/-)小鼠及Keap1(-/-)小鼠，以及相应的体外成骨细胞，验证压力负荷试验对骨细胞的影响；同时采用RT-qPCR及（RNA- SEQ）对预选出的基因进行定量计算和整个转录组测序，采用Western bolt对氧化应激相关蛋白ROS,OPN,OPG等进行检测，明确Nrf2是通过抑制氧化应激反应来促进负荷诱导的骨形成的机制，揭示骨质代谢的生物传导分子机制，为临床骨代谢提供了新的治疗靶向。

骨质疏松症是中老年最常见的疾病之一，目前全世界约有2亿患者，而我国患者已超过8000万，由此引起骨折病例为1500万。由于骨质疏松症多发在老年患者，特别是绝经期的女性，多伴随组织器官老化，生理功能下降，导致临床骨折后难愈合、难康复，具有很高的致残率和病死率。因此，临床如何对抗骨质疏松，改善骨代谢，促进骨折后愈合是当今世界医学界亟待解决的难题。.骨质疏松症的病因病机非常复杂，最新的观点表明，负荷（运动）可增加线粒体的活性，诱导骨细胞的氧化应激反应的正向作用，但是如果骨细胞中ROS水平的过高对机械诱导的骨形成却有负面影响。核转录因子2（Nrf2）是调节细胞氧化还原状态的主要分子，是小鼠体内维持骨微结构的关键因子。Nrf2（-/-）小鼠的骨体积和骨形成参数（矿化表面积、矿化沉积率、骨形成率）均显著降低，说明Nrf2缺失可抑制骨形成。 因此从Nrf2入手，研究其在氧化应激反应对骨代谢的作用，对临床骨愈合具有非常重要的意义。.本研究通过体内及体外实验，完成了Nrf2在运动(负荷)促进小鼠骨量增加中的作用机制研究、内源性大麻素受体CNR2在促进成骨细胞分化中自噬及p62介导的Nrf2相关作用研究。明确了运动（负荷）可以促进小鼠骨量增加，Nrf2基因敲除后小鼠骨量增加不明显；通过给予 CNR2激动剂处理成骨细胞，明确了CNR2 可促进成骨细胞分化，并通过自噬完成，在此过程中抑制了p62介导的Nrf2的活性。通过病毒转染过表达及沉默microRNA-187-3p，明确microRNA-187-3p可抑制成骨细胞前体细胞分化并通过抑制CNR2来完成。