HOXA3与TBX1 相互作用参与心脏发育及先天性心脏病发生的机制研究

Congenital heart disease(CHD) is the most common type of the birth defects among the newborn,which is the leading cause of birth death rate .Genetic factor is at the root of the disease and the heritability is about 55%～65%.We have prevoiusely reported that reduced ACTC1 expression might play a role in the onset of congenital heart disease by inducing cardiomyocte apoptosis.Further study has revealed that HOXA3 is its upstream regulation transcript factor and is down-regulated in the heart tissue of CHD.Furthermore,the interaction of HOXA3 and TBX1 is also revealed.All the discovery above has not been reported before. To elucidate the mechanism of HOXA3 and TBX1 interaction on the heart development and the onset of CHD, we plan to explore the conservative binding domain of the two transcript factors by GST-pull down.Then we set to detect the expression of the candidate downstream target genes of HOXA3 and TBX1 interaction,ACTC1 and Fgf10 genes, by the over-expression and the RNAi assay in the cell lines.Other candidate downstream genes will also be explored.The signaling pathway as found may then be verified by a transplacental RNAi mice model. In addition, mutation screening and expression analysis will be performed on heart tissues from CHD patients.The relationship of the candidate genes with CHD will be analyzed.Our study will elucidate the mechanism of HOXA3 and TBX1 interaction on the heart development as well as its relationship with CHD,which will be helpful for the prenatal diagnosis and intervention of CHD through gene therapy.

先天性心脏病（CHD）是常见重大出生缺陷，占新生儿非感染性死亡原因首位。其遗传因素具有重要作用，遗传率达55%～65%。申请者在前期研究中首次发现ACTC1基因表达水平降低与人类CHD相关，而HOXA3为其上游调控基因，在CHD患者中表达水平亦下调；深入研究发现TBX1与HOXA3为相互作用蛋白；上述发现在国内外均未见报道。为探讨HOXA3与TBX1互作参与CHD 的发生机制，本研究拟通过GST-pull down 方法明确二者的保守结合域；而后采用过表达及表达抑制实验检测二者互作的候选下游基因ACTC1及Fgf10的表达变化，并筛查其它受影响的下游基因；随后利用跨胎盘RNAi动物模型在体内验证上述研究结果；最后在CHD 患者标本中，对上述基因进行突变筛查及表达研究。结果可望阐明HOXA3与TBX1互作在心脏发育信号通路中的位置及作用，为CHD的产前诊断与遗传干预提供理论依据及治疗靶标。

先天性心脏病（CHD）是常见重大出生缺陷，占新生儿非感染性死亡原因首位。其遗传因素具有重要作用，遗传率达55%～65%。本项目旨在探讨HOXA3与TBX1互作参与CHD 的发生机制。结果可望阐明HOXA3与TBX1互作在心脏发育信号通路中的位置及作用，为CHD的产前诊断与遗传干预提供理论依据及治疗靶标。为明确HOXA3基因与TBX1基因表达的变化对候选下游基因ACTC1及Fgf8、Fgf10等基因表达的影响，项目组通过构建HOXA3基因与TBX1基因的表达载体及特异性siRNA在H9C2细胞系中进行过表达和表达抑制研究，结果发现ACTC1、Fgf8、Fgf10基因的 mRNA表达水平均上升/下调；Western Blot 结果表明Fgf8蛋白、Fgf10 蛋白表达水平增强/下调。采用SurePrint G3 Rat GE 8*60K Microarray基因表达谱芯片筛查鉴定HOXA3与TBX1相互作用在心脏发育中所影响的下游靶基因；明确二者在心脏发育分子调控通路中的位置及作用。筛查出系列与心脏发育及先天性心脏病发生相关的差异表达基因。根据分析结果，结合心脏发育相关基因文献，筛选出7个基因作为候选基因，分别为Tgfb 2，Sox9，Tab1，Tbx3，Cited2，Dll1， Mmp9基因。并采用实时定量PCR方法进行mRNA表达水平验证，结果发现此7个基因的表达有不同程度的变化。为探讨ACTC1基因表达下调诱导大鼠胚胎心肌细胞H9C2细胞凋亡的途径,在H9C2细胞系中转染ACTC1-siRNA后，ACTC1基因mRNA表达明显下调；TUNEL法检测结果表明，与转染scramble siRNA组比较，转染ACTC1-1 siRNA后， TUNEL阳性细胞率明显增加；Western blot法检测结果表明，ACTC1基因表达下调后Caspase-3 、Caspase-9及线粒体细胞色素C表达增高，差异有统计学意义；而 Caspase-8、Bcl-2及Bax 的表达量变化不显著,差异无统计学意义。结果表明ACTC1基因表达下调可能主要通过内源性线粒体信号转导途径诱导大鼠胚胎心肌细胞H9C2细胞凋亡。上述研究结果可望阐明HOXA3与TBX1互作在心脏发育信号通路中的位置及作用，为CHD的产前诊断与遗传干预提供理论依据及治疗靶标。