胰腺星状细胞-SHH-TRPV1在胰腺癌神经疼痛中的作用机制

Pain is one of the features for pancreatic cancer, which affects the quality of life seriously. Excessive hyperplasia of stromal tissue is the typical character of pancreatic cancer. Our former research found that SHH signal channel played an important role in activation of stromal, especially stellate cells. In addtion, we found that activated stellate cell, which caused perineural invasion. Perineural invasion is critical for pain in pancreatic cancer, so we surmise that SHH could activate stellate cells so that secrete neurotrophin, which regulate nerve growth and expression of nociceptor (TRPV1). The expression of TRPV1 could induce the release of pain factors. The subject contains that the co-culture system of cancer cells-stellate cells-dorsal root ganglion, the nude mice model of transplantable tumor. And qRT-PCR, Western blot, ELISA, immunofluorescent Staining, patch clamp and electrophysiological study will be employed in our subject. The pain mechanism of pancreatic cancer induced by SHH will be studied from molecule, cell to tissue level. Finally, we believe the subject will provide a new way for pain therapy in pancreatic cancer.

疼痛是胰腺癌重要的临床症状，严重影响患者生活质量。间质细胞过度增生导致间质纤维化是胰腺癌的典型病理特征。我们前期研究发现SHH信号通路在间质细胞尤其是星状细胞的活化和生物效应过程中起重要作用，SHH活化星状细胞促进肿瘤细胞和神经纤维的相向生长。因神经组织是胰腺癌疼痛的必备要素，故我们推测肿瘤细胞分泌的SHH活化胰腺星状细胞SHH信号通路，使其分泌相关神经营养因子，进而调节神经纤维的生长和痛觉感受器（TRPV1）的表达，促进疼痛介质释放引起疼痛。课题拟通过胰腺癌细胞-星状细胞-背根神经节体外共培养体系，裸鼠原位种植瘤模型的建立；应用qRT-PCR，Western blot，ELISA，免疫荧光化学，膜片钳电生理技术，VFF等方法从分子、细胞、组织和行为等不同层次，探讨分析SHH通路，星状细胞和TRPV1在胰腺癌疼痛中的相互关系。为胰腺癌疼痛的研究提供新思路。

目的：.通过体内、外实验，研究胰腺癌细胞对胰腺星状细胞sHH信号通路的作用及其对神经营养因子表达和分泌的影响，为临床治疗胰腺癌疼痛提供理论基础和治疗思路。..方法和结果：.1）胰腺癌标本中的神经组织高表达TRPV1和疼痛介质SP，CGRP。结合临床病例资料分析发现胰腺癌组织高表达的sHH与患者的疼痛症状和体征存在一定正相关性。.2）选择高表达sHH 基因的AsPc-1细胞株和低表达sHH基因的细胞株Panc-1作为转染对象。分别应用质粒转染和小干扰RNA成功构建了稳定高表达sHH基因的Panc-1细胞株（Panc-1-Sh-sHH），和低表达sHH基因的AsPc-1细胞（AsPc-1-Si-sHH）。.3）构建了胰腺癌细胞，星状细胞和背根神经节的不同共培养体系，结果显示胰腺星状细胞可促进背根神经节疼痛感受性受体TRPV1和疼痛介质SP，CGRP的表达。.4）癌细胞分泌的sHH蛋白可以活化星状细胞的sHH信号通路分子（SMO，Gli1和Gli2），并促使其高表达NGF和BDNF。.5）共培养体系中应用NGF或中和抗体，发现NGF可以正向调控背根神经节中TRPV1，SP和CGRP的表达和分泌，而其中和抗体则起到负向调控的作用。.6）应用膜片钳电生理技术检测神经元细胞的TRPV1。结果发现，NGF和sHH均能促进细胞膜TRPV1的电流活性，联合应用时更加强化了促进作用；而NGF中和抗体和sHH信号通路抑制剂则明显减弱TRPV1的电流活性。.7）构建裸鼠胰腺原位种植瘤模型，成瘤后应用机械痛敏测试仪（Von Frey Filament, VFF）评估胰腺疼痛的程度。发现高表达sHH基因的肿瘤模型对裸鼠胰腺疼痛相关行为的诱发作用明显要强于低表达sHH的肿瘤模型。.结论：.1）胰腺癌高表达sHH，且其与胰腺癌疼痛呈正相关。.2）胰腺星状细胞通过sHH信号通路的活化促进胰腺癌疼痛的发生，且其sHH信号通路的活化是由胰腺癌细胞分泌的sHH实现的。.3）胰腺星状细胞sHH信号通路对胰腺癌疼痛的促进作用，是通过其高表达神经营养因子实现的。.4）膜片钳从电生理发现sHH信号通路和NGF可明显促进共培养体系中背根神经节神经元细胞膜TRPV1的电流变化。.5）动物模型实验在体内验证了sHH信号通路和星状细胞对胰腺癌疼痛的促进作用。