植物叶绿体RNA编辑复合体识别靶标RNA的分子机制研究

RNA editing is a kind of post-transcriptional modification phenomenon, including nucleotide insertion/deletion and conversion, which is an important way of gene modification and regulation. In higher plants, RNA editing mainly occurs in plant mitochondria and chloroplasts. Studies have shown that PPR proteins and MORF proteins are two kinds of RNA editing factors. PPR and MORF mutants always result in abnormal organelle biogenesis, and even lead to plant developmental defects. PPR protein is a kind of RNA-binding protein, which is responsible for target RNA recognition. PPR protein can be divided into P and PLS subfamilies, those involved in RNA editing all belong to the PLS subfamilies. Different to its counterpart P-type PPR, it remains unclear how PLS-type PPR repeats recognize the target RNA bases. The understanding of the molecular mechanisms on how MORF proteins interact with PLS-type PPR proteins is not comprehensive enough. To decipher the molecular basis how PLS repeats recognize the RNA bases as well as its cognition with MORF, we aim to determine the crystal structures of the chloroplast PLS-type PPR protein in complex with MORF protein in the absence or presence of target RNA in this project. This will lay a solid foundation for our understanding on the molecular basis of RNA editing as well as plant chloroplast development.

RNA编辑是一类RNA转录后修饰现象，包括核苷酸的插入/缺失和转换，是基因修饰和调控的重要方式。在高等植物中RNA编辑主要发生在植物线粒体和叶绿体中。研究表明PPR蛋白和MORF蛋白是两类重要的编辑因子。PPR和MORF突变体会引起细胞器生物发生异常，导致植物生长发育障碍。其中，PPR蛋白是一类RNA结合蛋白，其负责靶标RNA的识别。PPR蛋白家族分为P和PLS两个亚家族，而参与RNA编辑的都属于PLS亚家族。和P类型不同，PLS类型PPR不同重复单元识别RNA碱基的分子机制仍不清楚。而对MORF蛋白和天然PLS类型PPR相互作用的分子机制理解的还不够全面。本研究旨在解析叶绿体中PLS类型PPR蛋白和MORF9蛋白二元复合物以及结合RNA的三元复合物的晶体结构，从而阐明不同PLS重复单元识别RNA碱基及其结合MORF的分子机理。为深入理解叶绿体中RNA编辑分子机理及叶绿体发育奠定分子基础。

RNA编辑是一类转录后修饰，主要发生于植物线粒体和叶绿体中。RNA编辑的发生对于RNA转录本功能的正常发挥至关重要。目前已经鉴定到一系列的RNA编辑因子，包括PPR蛋白，MORF蛋白，ORRM蛋白，OZ1，PPO1等，我们综述了这些编辑因子可能形成编辑体及催化编辑发生的方式，这部分内容发表于Science China Life Sciences (2018)。. PPR蛋白和MORF蛋白是编辑体的核心组成成分。PPR蛋白在植物中是一类很大的蛋白质家族，是一类RNA结合蛋白，负责靶标RNA的识别结合。而MORF蛋白是一类小的蛋白质家族，主要发挥调控作用。在本研究中，我们通过酵母双杂交实验系统筛选了叶绿体定位的MORF2，MORF8，MORF9和PLS/PPR蛋白的相互作用网络，发现不同的成员之前有特异性识别，但其差异性的识别机制以及生理功能还有待于进一步解析。对其中的一些组合，我们体外重组获得了蛋白复合物，并验证了复合物可以识别结合RNA，遗憾的是晶体筛选并没有获得复合物晶体，下一步我们着手尝试采用冷冻电镜的手段去解析复合物的结构，揭示其识别RNA的机制。在本研究中，我们还高通量的构建了一系列的人工设计的PPR蛋白，通过EMSA和ITC等生化手段系统破解了PPR蛋白识别RNA碱基的密码，基于此，我们开发了PPR蛋白靶标预测在线程序。相关研究结果发表在Nucleic Acids Research杂志（2019）。目前，已经有海内外上千人次的科研同行使用该服务，有利的促进了PPR蛋白的功能研究。. 在本项目的资助下，我们还开展了叶绿体特定DNA结构Holliday junction（HJ）识别及切割蛋白HJ解离酶MOC1发挥作用的分子机制研究。我们解析了MOC1单体以及结合HJ的复合体晶体结构。通过结构分析，我们不仅鉴定了MOC1的催化核心氨基酸，而且发现了一个重要的碱基识别环，其中有两个关键的氨基酸参与了特定的碱基识别，从而决定了序列识别以及切割的特异性。这类碱基识别环在不同物种的HJ解离酶中是保守存在的，本研究首次从分子水平上解析了HJ解离酶序列特异性切割DNA的分子机制。相关研究结果发表在Nature Communications杂志（2020）。