巴西橡胶树HbICE1互作蛋白的筛选与功能鉴定研究

Chilling stress is one of the major natural disasters in the rubber planting area of our country. It not only affects the rubber production but also threatens the survival of the rubber tree.ICE1 is a transcriptional activator in the cold-response pathway in Arabidopsis thaliana. It also modulates the cross-talk between cold and jasmonate (a key signal regulator for laticifer differentiation and latex synthesis) signaling pathways. However, most of the key genes including HbICE1 in the cold-response pathways of Hevea brasiliensis have not been cloned yet, and the proteins interacted with HbICE1 are unclear, which strongly hampered the advance further research of molecular mechanism for chilling tolerance of Hevea brasiliensis. In the previous work, we first cloned the key cold response related genes and successfully constructed rubber yeast two-hybrid cDNA library. In this work, we intend to study the physiological function of the cloned gene through plant transformation. Additionally, we plan to screen the proteins interacted with HbICE1 through yeast two-hybrid method and verify the interaction between HbICE1 and the target gene using bimolecular flurescent complementation (BiFC). Finally, we will investigate whether the transcription factor interacted with HbICE1 could specifically bind the promoter of latex synthesis genes and activate their transcription. This work will lay an important theoretical basis for the molecular mechanism of rubber tree response to chilling stress and technical improvement of breeding high-yielding and chilling-resistant rubber tree.

寒害是我国植胶区的主要自然灾害之一，不仅影响橡胶产量还威胁橡胶树的生存。拟南芥中，ICE1是低温胁迫信号通路中的重要转录激活因子，也是连接冷信号和茉莉酸（茉莉酸是决定乳管分化和橡胶树产量的关键激素）信号的关键基因。但橡胶树冷胁迫信号途径中包括HbICE1在内的大部分关键基因尚未被克隆与鉴定，与HbICE1蛋白发生互作的基因还不清楚，成为严重阻碍橡胶抗寒分子机理研究的瓶颈。在前期工作中，我们电子克隆了橡胶冷胁迫信号途径中关键基因，还成功构建了橡胶酵母双杂交cDNA文库。本项目拟通过植物转化来验证所克隆基因的抗寒功能；采用酵母双杂交筛选HbICE1的互作蛋白，用双分子荧光互补技术验证HbICE1与目标蛋白之间的互作；还将利用酵母单杂的方法探讨与HbICE1互作的转录因子是否与胶乳合成相关基因的启动子发生互作，为橡胶抗寒机理研究和寻找耐寒且高产的橡胶品种提供重要理论依据。

寒害是我国植胶区的主要自然灾害之一，不仅影响橡胶产量还威胁橡胶树的生存,但橡胶树冷胁迫信号途径中包括HbICE1在内的大部分关键基因尚未被克隆与鉴定，与HbICE1蛋白发生互作的基因还不清楚，成为严重阻碍橡胶抗寒分子机理研究的瓶颈。本研究克隆了橡胶树低温胁迫应答过程中的关键基因，鉴定了HbICE1/2的生物学功能，筛选和鉴定与橡胶树HbICE1 蛋白发生互作的蛋白，阐明了茉莉酸对橡胶树低温应答的影响及分子机理，为探索橡胶树耐寒机理提供了一定的理论依据，主要研究结果如下：.1.从巴西橡胶树中克隆了HbICE1/2、HbCBF2/3基因，氨基酸序列比对以及进化树分析表明扩增得到这些基因与其他物种中同族基因存在高度同源性。.2.利用实时荧光定量PCR对HbICE1的表达模式进行分析，结果表明： HbICE1在叶片和树皮中表达量都较高，并且HbICE1受低温、创伤、高盐及脱水胁迫的诱导。.3.转录激活实验证明，HbICE1和HbICE2具有转录激活活性，且活性区域位于HbICE1/2的N端。酵母单杂交结果显示：HbICE1和HbICE2均可以和MYCR顺式作用元件结合。.4.通过酵母双杂交及BiFC将筛选出与HbICE1相互作用的候选蛋白经过一对一验证后，最后确定能与HbICEs相互作用的蛋白有HbJAZ1，HbJAZ12，HbSnRK2.6A-E，HbNTF4以及HbHLH70蛋白。.5.在拟南芥中分别过量表达HbICE1/2，转基因植株35S::HbICEs表现出抗寒性能，转基因植株的存活率、脯氨酸和叶绿素含量高于野生型，而丙二醛含量，电导率和H2O2的积累都低于野生型。.6.通过对低温处理前后橡胶树进行RNA-Seq测序，差异表达基因分析结果表明：橡胶树低温胁迫能够改变植物激素信号转导途径的基因表达谱，乙烯、JA、ABA和ICE-CBF都共同调控橡胶树的抗寒性能。.7.外源施加茉莉酸甲酯（MeJA）能够显著提高橡胶树的抗寒性能，与不施加茉莉酸的植株相比其存活率、脯氨酸和叶绿素含量较高，而丙二醛含量，电导率和H2O2的积累较少，并且ICE-CBF相关基因的表达量都有一定的上升。.8.双荧光素酶瞬时转化实验表明：JA信号途径中的关键调控因子HbJAZ1和HbJAZ12蛋白能够抑制HbICE2的转录功能。.9.克隆并初步鉴定了HbICE1相互作用蛋白的生物学功能。