宫颈癌中HPV16整合至3p14位点的鉴定及其在宫颈癌发生中的致病机理研究

HPV integration is a key genetic event in the development of cervical cancer, but the molecular mechanisms by which HPV integration induces cervical carcinoma remain unclear at present. Our preliminary data showed that HPV16 integrated into the human genomic 3p14 region with high frequency in cervical carcinomas and the copy number of FHIT gene at 3p14 region was significantly decreased. We speculate that HPV integration may affect the expression and function of FHIT gene on 3p14. In this project, we will use DIPS-PCR, Sanger sequencing and fluorescence in situ hybridization (FISH) to confirm HPV integrations at 3p14 in larger sample volume. We will also simulate the integration of HPV 16 at 3p14 site by CRISPR/Cas technique both in vitro and in three-dimensional organotypic raft culture system. The underlying mechanisms of HPV integration and the molecular features of malignantly transformed cervical epithelium will be investigated. The effects of HPV integration on the expression of FHIT gene at 3p14 region, as well as the involved signal transduction systems, will be analyzed by immunochemistry, FISH, Western-blot, co-immunoprecipitation and other techniques. Our study will provide more insight to the control and screening strategies of cervical carcinoma in the future.

高危型人乳头瘤病毒（HPV）整合到人基因组是宫颈癌发生的使动因素，但其具体机制不清楚。本项目前期研究发现宫颈癌中HPV16整合至3p14位点频率较高，整合标本中该位点FHIT基因拷贝数降低。因此，本项目拟在大样本中采取DIPS-PCR结合普通PCR测序和双色荧光原位杂交FISH检测，鉴定3p14是宫颈癌中HPV16的整合热点；采取3p14区域重测序，并结合临床资料，分析HPV整合规律、整合机制与临床意义；构建HPV16定点整合于3p14位点的体外细胞系及筏式三维培养模型，运用免疫组化、细胞增殖及凋亡检测等手段探讨HPV16定点整合于3p14位点后宫颈上皮恶性转化的分子特征，及HPV定点整合对该位点FHIT基因表达及其下游信号通路的影响，在体外阐明HPV16特异整合至3p14位点在宫颈癌发生发展中的致病机理，为进一步评估HPV整合热点3p14在宫颈癌预警及靶向治疗中的价值奠定理论基础。

宫颈癌是全球范围内最常见的妇科恶性肿瘤之一，而HPV整合是导致宫颈癌变的关键分子事件，但其具体整合及致癌机制不清。本项目前期研究发现宫颈癌中HPV16整合至3p14位点频率较高，且整合标本中该位点处的FHIT基因拷贝数降低。因此，本项目在前期研究基础之上，扩大样本量，进行HPV病毒捕获测序及DIPS-PCR技术检测HPV的整合情况，除了鉴定并计算POU5F1B、FHIT（3p14）、KLF12 、KLF5、LRP1B 和LEPREL1等既往被发现的整合热点及整合频率之外，我们还发现了3个新的整合热点：HMGA2、DLG2、SEMA3D。同时通过对HPV-cellular断点的序列分析发现，在断点附近存在HPV基因组与人基因组的微同源序列富集，进而提出微同源介导的HPV整合机制，首次对于HPV的整合机制予以回答。进一步分析HPV整合断点附近的基因，大部分是与癌症密切相关的癌基因及抑癌基因。免疫组化及FISH荧光原位杂交发现，随着HPV拷贝数增加，整合位点附近的癌基因表达上调，抑癌基因表达下调，且与癌变进展明显相关，提出了其作为临床预警CIN进展标记物的可行性。在明确HPV精确的整合位点之后，本项目独创设计了特异针对HPV E6 /E7的锌指核酶（ZFN）、转录激活效应因子核酸酶(TALEN)和规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR），实现HPV致癌基因敲除的目的；并通过宫颈癌模式小鼠阴道内转染针对HPV E6/E7的TALEN，成功清除HPV病毒，逆转宫颈癌前病变。综上所述，本项目鉴定了多个HPV高频整合位点（包括FHIT）；阐述了HPV的具体整合机制；证实了以HPV整合及其影响的癌基因及抑癌基因作为临床预警CIN进展标记物的可行性；并进一步以HPV整合为切入点，开发基因编辑工具靶向清除HPV，提供了治疗HPV感染及其相关的宫颈恶性肿瘤的策略。