miRNAs和信号通路在艾滋病毒Vpr蛋白调控卡波氏肉瘤病毒潜伏感染中的作用和意义

HIV-1与卡波氏肉瘤病毒（KSHV）共感染导致AIDS相关的卡波氏肉瘤（AIDS-KS）频繁发生。AIDS-KS预后差，往往在两年内死亡。我们前期的研究表明，HIV-1 Tat蛋白不仅通过调控Jak/Stat信号通路来调节KSHV潜伏与复制（J Virol,2007,81:2401）；而且还能够增强KSHV编码的Kaposin A致瘤（Neoplasia,2009,11:1272）。与Tat类似，HIV-1 Vpr蛋白也可以释放到血清中被体内多种细胞所吸收，那么Vpr是否有可能通过某种机制来影响KSHV潜伏感染，参与AIDS-KS的发生？.本研究的目的是证实Vpr能够增强KSHV潜伏感染；鉴定调控Vpr增强KSHV潜伏感染的重要miRNA分子与关键信号通路；寻找miRNA与关键信号通路之间存在的关系。.本研究有助于阐明AIDS-KS发病分子机制，为AIDS-KS治疗提供有效分子靶点。

本项目研究中，我们首先原核表达和纯化了HIV-1 Vpr蛋白，将该重组蛋白与潜伏感染KSHV的PEL细胞系BC3、BCBL-1细胞共同孵育，共聚焦显微镜下观察到可溶性Vpr蛋白被内化，主要积聚在胞浆和核内。real-time quantitative PCR（RT-qPCR）和Western blotting等方法检测与Vpr蛋白共同孵育的PEL细胞系中潜伏感染KSHV的多个裂解期基因mRNA转录、蛋白表达和子代病毒颗粒的释放。结果表明，可溶性Vpr蛋白不但下调KSHV裂解期基因mRNA的转录、蛋白表达，而且抑制KSHV子代病毒颗粒的释放。. 信号通路的研究发现，Vpr抑制KSHV复制的同时，一方面能够下调Notch信号通路的关键蛋白，另一方面可以促进NF-κB信号通路的活化。随后采用慢病毒载体介导Notch信号通路关键蛋白ICN在与Vpr共同孵育的PEL细胞中过表达。结果显示，过表达ICN能够一定程度上逆转Vpr抑制的KSHV复制。类似地，采用慢病毒载体介导IκBα显性负相结构（IκBα-DN）在与Vpr共同孵育的PEL细胞中过表达。结果表明，过表达IκBα-DN抑制NF-κB信号通路能够一定程度地逆转Vpr抑制的KSHV复制。更为重要的是，当在与可溶性Vpr共孵育的PEL细胞中过表达IκBα-DN 并不影响Notch通路中关键蛋白ICN、Hes 1和Hey1的表达。相反，在上述细胞中过表达Notch关键分子ICN却能够抑制NF-κB通路的活化，表现为增强IκBα蛋白的表达、抑制p65核转位等。综合以上结果表明，可溶性HIV-1 Vpr通过抑制宿主细胞Notch信号通路并活化NF-κB信号来增强KSHV的潜伏感染。最后采用microRNA microarray、生物信息学分析和定点突变等技术鉴定了一个细胞miR-942-5p。功能获得和功能丧失实验证实，可溶性Vpr蛋白通过上调细胞miR-942-5p靶向IκBα活化NF-κB信号通路来增强KSHV的潜伏感染。. 总之，完成该项目后在SCI收录期刊上共发表研究论文9篇，累计影响因子超过55。项目实施期间共培养毕业4位博士研究生和6名硕士研究生。申请国家发明专利1项，10人次参加国际学术会议，其中2人次做大会报告，1人次墙报。举办1次国内大型学术会议，参加人数105人。